Целью данного протокола является описание подхода к анализу поведения взрослых нервных стволовых/протеже клеток в ответ на хемогенетические манипуляции определенной локальной нейронной цепи.
Взрослый нейрогенез – это динамический процесс, при котором вновь активированные нервные стволовые клетки (Нск) в подгранулярной зоне (СГЗ) зубной извилины (ДГ) генерируют новые нейроны, которые интегрируются в существующую нейронную цепь и способствуют специфическим функциям гиппокампа . Важно отметить, что взрослый нейрогенез очень восприимчив к экологическим стимулам, что позволяет для активности-зависимых регуляции различных когнитивных функций. Широкий спектр нейронных цепей из различных областей мозга организует эти сложные когнитивные функции. Поэтому важно понять, как конкретные нейронные цепи регулируют нейргенез взрослых. Здесь мы описываем протокол для манипулирования нейронной цепной активности с помощью дизайнера рецептора исключительно активируется дизайнер наркотиков (DREADDs) технологии, которая регулирует NSCs и новорожденных потомства у грызунов. Этот всеобъемлющий протокол включает в себя стереотаксические инъекции вирусных частиц, хемогенетическую стимуляцию конкретных нейронных цепей, аналоговое администрирование тимидина, обработку тканей, маркировку иммунофлюоресценции, конфокальную визуализацию и визуализацию анализ различных стадий нейронных клеток-предшественников. Этот протокол содержит подробные инструкции по методам поиска антигена, используемым для визуализации NSCs и их потомства и описывает простой, но эффективный способ модулировать мозговые цепи с помощью клозапина N-оксида (CNO) или CNO-содержащей питьевой воды и DREADDs-выражающие вирусы. Сила этого протокола заключается в его адаптивности для изучения широкого спектра нейронных цепей, которые влияют на взрослых нейрогенеза, полученные из NSCs.
Взрослый нейрогенез является биологическим процессом, с помощью которого новые нейроны рождаются во взрослом возрасте и интегрированы в существующие нейронные сети1. У людей этот процесс происходит в зубной извилине (DG) гиппокампа, где около 1400 новых клеток рождаются каждый день2. Эти клетки находятся во внутренней части ГД, которая таит в себе нейрогенную нишу, именуемую субгралярной зоной (СГЗ). Здесь гиппокампа взрослых нервных стволовых клеток (NSCs) проходят сложный процесс развития, чтобы стать полностью функциональными нейронами, которые способствуют регуляции конкретных функций мозга, в том числе обучения и памяти, регулирование настроения, и стресс ответ3 ,4,5,6. Чтобы влиять на поведение, взрослые НСК строго регулируются различными внешними стимулами в деятельности, зависимой от этого, реагируя на массив местных и дистальных химических сигналов. Эти химические сигналы включают нейротрансмиттеров и нейромодуляторов и действовать в цепи определенным образом из различных областей мозга. Важно отметить, что широкая конвергенция этих химических сигналов на НСК позволяет проводить уникальную и точную регуляцию активации стволовых клеток, дифференциацию и судьбу решений.
Одним из наиболее эффективных способов допроса регулирования схем взрослых NSCs in vivo является сопряжение иммунофлуоресценции анализа с цепью широкие манипуляции. Иммунофлуоресценция анализ взрослых НСК является широко используемым методом, где антитела против конкретных молекулярных маркеров используются для обозначения стадии развития взрослых НСК. Эти маркеры включают в себя: nestin как клетка радиальной глии и ранний нейронный маркер прародителя, Tbr2 как промежуточный маркер прародителя, и dcx как нейробласт и незрелый маркер нейронов7. Кроме того, путем введения тимидина аналогов, таких как BrdU, CidU, Idu, и Edu, популяции клеток, проходящие фазу S могут быть индивидуально помечены и визуализированы8,9,10. Объединив эти два подхода, широкий спектр вопросов может быть исследован, начиная от того, как распространение регулируется на конкретных стадиях развития, как различные сигналы влияют на дифференциацию НСК и нейрогенез.
Существует несколько вариантов эффективного управления нейронными схемами, включая электрическую стимуляцию, оптогенетику и хемогенетику, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Электрическая стимуляция включает в себя обширную операцию, где электроды имплантируются в конкретную область мозга, которые позже используются для передачи электрических сигналов для модулирования целевой области мозга. Однако, этот подход не хватает как клеточной и цепи специфики. Оптогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют свет активированный рецептор, который стимулируется лазером, испускаемым через имплантированное оптическое волокно, но требует обширных манипуляций, больших затрат и сложных операций11. Хемогенетика включает в себя доставку вирусных частиц, которые кодируют дизайнерский рецептор, исключительно активированный дизайнерскими препаратами или DREADDs, которые впоследствии активируются специфическим и биологически инертным лигандом, известным как клозапин N-оксид (CNO)12 . Преимущество использования DREADDs для манипулирования локальными нейронными схемами, которые регулируют взрослые НСК, заключается в легкости и различных маршрутах управления CNO. Это позволяет менее трудоемкий подход с сокращением обработки животных, который легко адаптируется для долгосрочных исследований, чтобы модулировать нейронных цепей.
Подход, описанный в этом протоколе, представляет собой всеобъемлющий набор различных протоколов, необходимых для успешного допроса схемы регулирования взрослых гиппокампа нейрогенеза, который сочетает в себе как методы иммунофлюоресценции и схемы манипуляций с помощью хемогенетики. Метод, описанный в следующем протоколе, подходит для стимулирования или ингибирования одной или нескольких цепей одновременно in vivo, чтобы определить их регулирующую функцию на взрослых нейрогенеза. Этот подход лучше всего использовать, если вопрос не нуждается в высокой степени временного разрешения. Вопросы, требующие точного временного контроля стимуляции / ингибирования на определенной частоте, могут быть лучше решены с помощью оптогенетики13,14. Описанный здесь подход легко адаптируется для долгосрочных исследований с минимальным обращением с животными, особенно в тех случаях, когда стресс является серьезной проблемой.
Цель этого протокола заключается в оценке того, как манипулирование конкретными нейронными схемами регулирует гиппокампа нейрогенеза в виво с помощью ряда методов иммуногистохимии. Анализ активности зависимой регуляции взрослого нейрогенеза, опосредоченного конкретными нейронным?…
The authors have nothing to disclose.
Л.Д.З. была поддержана Национальным институтом психического здоровья Национальных институтов здравоохранения в соответствии с дополнением к разнообразию R01MH111773, а также грантом T32 на обучение T32NS007431-20. Этот проект был поддержан из грантов, присужденных J.S. от NIH (MH111773, AG058160 и NS104530).
24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
Cotton Swabs | Amazon | ||
Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
Leica M80 | Leica | ||
Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
Small Animal Heating Pad | K&H | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
Tweezers | Amazon | ||
Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |