Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Volwassen neurogenese is een biologisch proces waarbij nieuwe neuronen worden geboren in een volwassene en geïntegreerd in de bestaande neurale netwerken¹. Bij de mens, dit proces vindt plaats in de getand gyrus (DG) van de hippocampus, waar ongeveer 1.400 nieuwe cellen worden geboren elke dag². Deze cellen bevinden zich in het binnenste gedeelte van het DG, dat een neurogene niche herbergt, aangeduid als de subgranulaire zone (SGZ). Hier, hippocampal volwassen neurale stamcellen (NSCs) ondergaan een complex ontwikkelingsproces volledig functionele neuronen die bijdragen aan de regulering van specifieke hersenfuncties, met inbegrip van leren en geheugen, stemming verordening, en stress response^{3 worden ,4,5,6}. Om gedragingen te beïnvloeden, worden volwassen NSCs sterk gereguleerd door verschillende externe stimuli in een activiteitsafhankelijke manier door te reageren op een array van lokale en distale chemische signalen. Deze chemische aanwijzingen omvatten neurotransmitters en neuro modulatoren en handelen in een circuit specifieke manier uit verschillende hersengebieden. Belangrijk is dat de brede convergentie van deze chemische signalen op NSCs een unieke en precieze regulering van stamcel activering, differentiatie en noodlotbeslissingen mogelijk maakt.

Een van de meest effectieve manieren om circuit regulering van volwassen NSCs in vivo te interromen is door immunofluorescentie analyse te koppelen aan schakelingen met een breed circuit. Immunofluorescentie analyse van volwassen NSCs is een algemeen gebruikte techniek, waarbij antilichamen tegen specifieke moleculaire markers worden gebruikt om de ontwikkelingsfase van volwassen NSCs aan te duiden. Deze markers omvatten: nestin als een radiale glia cel en vroege neurale voorlopercellen marker, Tbr2 als een tussenliggende voorlopercellen marker, en DCX als een neuro blast en onvolgroeide neuron marker⁷. Bovendien, door het toedienen van thymidine analogen zoals Brdu, cidu, Idu, en edu, kunnen celpopulaties die S-fase ondergaan individueel worden gelabeld en gevisualiseerd^8,9,10. Door deze twee benaderingen te combineren, kan een breed scala aan vragen worden onderzocht, variërend van hoe proliferatie wordt gereguleerd in specifieke ontwikkelingsstadia, tot hoe verschillende signalen de NSC-differentiatie en neurogenese beïnvloeden.

Verschillende opties bestaan om effectief te manipuleren neurale circuits met inbegrip van elektrische stimulatie, optogenetics, en chemogenetica, elk met hun eigen voor-en nadelen. Elektrische stimulatie omvat een uitgebreide operatie waarbij elektroden worden geïmplanteerd naar een specifieke hersenregio die later worden gebruikt voor het verzenden van elektrische signalen om een gerichte hersenregio te moduleren. Echter, deze aanpak mist zowel cellulaire en circuit specificiteit. Optogenetics omvat de levering van virale deeltjes die coderen een licht geactiveerde receptor die wordt gestimuleerd door een laser uitgezonden door een geïmplanteerde optische vezel, maar vereist uitgebreide manipulaties, grote kosten, en complexe operaties¹¹. Chemogenetics omvat de levering van virale deeltjes die coderen een ontwerper receptor uitsluitend geactiveerd door designer drugs of DREADDs, die vervolgens worden geactiveerd door een specifieke en biologisch inert ligand bekend als Clozapine N-oxide (CNO)¹² . Het voordeel van het gebruik van DREADDs voor het manipuleren van lokale neurale circuits die volwassen NSCs reguleren ligt in het gemak en verschillende routes van CNO administratie. Dit zorgt voor een minder tijdrovende aanpak met verminderde behandeling van dieren, die gemakkelijk aanpasbaar is voor lange termijn studies om neurale circuits te moduleren.

De aanpak beschreven in dit protocol is een uitgebreide verzameling van verschillende protocollen die nodig zijn om met succes te interroten circuit regulering van volwassen hippocampal neurogenese die zowel immunofluorescentie technieken en circuit manipulaties combineert met behulp van chemogenetica. De in het volgende protocol beschreven methode is geschikt voor het stimuleren of remmen van één of meerdere circuits tegelijkertijd in vivo om hun regelgevende functie bij volwassen neurogenese te bepalen. Deze aanpak wordt het best gebruikt als de vraag niet een hoge mate van temporele resolutie nodig heeft. Vragen die nauwkeurige temporele controle van stimulatie/remming op een bepaalde frequentie, kunnen beter worden aangepakt met behulp van optogenetics^13,14. De hier beschreven aanpak is gemakkelijk aangepast voor lange termijn studies met minimale behandeling van dieren, vooral wanneer stress een grote zorg is.