Summary

Regulação específica do circuito de assaying de células precursoras neurais hipocampais adultas

Published: July 24, 2019
doi:

Summary

O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.

Abstract

A neurogênese adulta é um processo dinâmico pelo qual as células-tronco neurais recém-ativadas (NSCS) na zona zona (SGZ) do giro dentado (DG) geram novos neurônios, que se integram em um circuito neural existente e contribuem para funções hipocampais específicas . É importante ressaltar que a neurogênese adulta é altamente suscetível a estímulos ambientais, o que permite a regulação dependente da atividade de várias funções cognitivas. Uma vasta gama de circuitos neurais de várias regiões do cérebro orquestrates estas funções cognitivas complexas. Portanto, é importante entender como os circuitos neurais específicos regulam a neurogênese adulta. Aqui, nós descrevemos um protocolo para manipular a atividade do circuito neural usando o receptor do desenhador ativado exclusivamente pela tecnologia das drogas do desenhador (dreadds) que regula NSCS e o progênie recém-nascido nos roedores. Este protocolo detalhado inclui a injeção Stereotaxic de partículas virais, a estimulação chemogenetic de circuitos neural específicos, a administração análoga do timidina, o processamento do tecido, a rotulagem da imunofluorescência, a imagem latente confocal, e a imagem latente análise de vários estágios de células precursoras neurais. Este protocolo fornece instruções detalhadas sobre técnicas da recuperação do antígeno usadas para visualizar NSCS e seus progênie e descreve uma maneira simples, contudo eficaz de modular circuitos do cérebro usando o N-óxido do Clozapine (CNO) ou CNO-que contem a água bebendo e Vírus que expressam DREADDs. A força deste protocolo reside na sua adaptabilidade para estudar uma gama diversificada de circuitos neurais que influenciam a neurogênese adulta derivada de NSCs.

Introduction

A neurogênese adulta é um processo biológico pelo qual novos neurônios nascem em um adulto e integrados nas redes neurais existentes1. Nos seres humanos, este processo ocorre no giro dentado (DG) do hipocampo, onde cerca de 1.400 novas células nascem a cada dia2. Estas células residem na parte interna da DG, que abriga um nicho neurogênico, denominado zona zona (SGZ). Aqui, células-tronco neurais adultas hipocampais (NSCs) passam por um processo complexo de desenvolvimento para se tornarem neurônios totalmente funcionais que contribuem para a regulação de funções cerebrais específicas, incluindo aprendizagem e memória, regulação do humor e resposta ao estresse3 ,4,5,6. Para influenciar comportamentos, os NSCs adultos são altamente regulados por vários estímulos externos de uma forma dependente da atividade, respondendo a uma variedade de pistas químicas locais e distais. Estas pistas químicas incluem neurotransmissores e Neuromoduladores e atuam em um circuito de maneira específica de várias regiões cerebrais. Importante, a convergência de circuito largo destes sinais químicos em NSCs permite o regulamento original e preciso da ativação, da diferenciação, e das decisões do Fate da pilha de haste.

Uma das maneiras mais eficazes de interrogar a regulação do circuito de NSCs adultos in vivo é através da análise de imunofluorescência de emparelhamento com manipulações de circuito largo. A análise da imunofluorescência de NSCs adultos é uma técnica comumente utilizada, onde os anticorpos contra marcadores moleculares específicos são usados para indicar o estágio de desenvolvimento de NSCs adultos. Estes marcadores incluem: Nestin como uma pilha radial do glia e um marcador neural adiantado do progenitor, Tbr2 como um marcador intermediário do progenitor, e DCX como um marcador do neuroblast e do neurônio imaturo7. Adicionalmente, através da administração de análogos da timidina como BrdU, Cidu, IDU e edu, as populações de células submetidas à fase S podem ser rotuladas individualmente e visualizadas8,9,10. Combinando essas duas abordagens, uma ampla gama de perguntas pode ser investigada, variando de como a proliferação é regulada em estágios específicos de desenvolvimento, a forma como várias pistas afetam a diferenciação de NSC e a neurogênese.

Existem várias opções para manipular eficazmente os circuitos neurais, incluindo a estimulação elétrica, optogenética e quimiogenética, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. A estimulação elétrica envolve uma cirurgia extensiva onde os elétrodos estão implantados a uma região específica do cérebro que sejam usadas mais tarde para transmitir sinais elétricos para modular uma região alvejada do cérebro. No entanto, esta abordagem carece de especificidade celular e de circuito. A optogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor ativado por luz que é estimulado por um laser emitido através de uma fibra óptica implantada, mas requer manipulações extensas, grande custo e cirurgias complexas11. A quimiogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor de designer ativado exclusivamente por drogas de grife ou DREADDs, que são subsequentemente ativados por um ligador específico e biologicamente inerte conhecido como N-óxido de clozapina (CNO)12 . A vantagem de utilizar DREADDs para manipular circuitos neurais locais que regulam NSCs adultos reside na facilidade e várias rotas de administração CNO. Isto permite uma aproximação menos demorada com manipulação animal reduzida, que é facilmente adaptável para estudos a longo prazo para modular circuitos neural.

A aproximação descrita neste protocolo é uma coleção detalhada de vários protocolos exigidos para interrogar com sucesso a regulação do circuito da neurogênese hippocampal adulta que combina técnicas da imunofluorescência e manipulações do circuito usando a quimiogenética. O método descrito no seguinte protocolo é apropriado para estimular ou inibir um ou vários circuitos simultaneamente in vivo para determinar sua função reguladora na neurogênese adulta. Essa abordagem é melhor usada se a pergunta não precisar de um alto grau de resolução temporal. As perguntas que exigem o controle temporal preciso da estimulação/inibição em uma determinada freqüência, podem melhor ser endereçadas usando o optogenetics13,14. A aproximação descrita aqui é adaptada facilmente para estudos a longo prazo com manipulação animal mínima especial onde o stress é uma preocupação principal.

Protocol

Todos os procedimentos, incluindo os sujeitos animais, foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de North Carolina Chapel Hill. 1. injeção Stereotaxic de partículas virais Determine os circuitos neurais em questão. Isso determinará o vírus e a linha do mouse utilizadas para o procedimento a seguir.Nota: Para este exemplo, as projeções Mossy contralaterais da pilha são estimuladas para analisar seus ef…

Representative Results

Seguindo os procedimentos experimentais descritos acima (Figura 1a,B), pudemos determinar os efeitos de estimular projeções de células Mossy contralaterais no nicho neurogênico dentro do hipocampo. Usando um CRE-dependente GQ-acoplado estimulando o vírus de DREADD emparelhado com uma pilha Mossy que etiqueta 5-HT2A CRE-linha, nós pudemos ativar seletivamente projeções excitatórias das pilhas Mossy na DG contralateral e determinamos que a pilha Mossy forte estimulaç…

Discussion

O objetivo deste protocolo é avaliar como manipular circuitos neurais específicos regula a neurogênese hipocampal adulta in vivo usando uma série de técnicas immunohistochemistry. O Regulamento dependente da atividade de assaying da neurogênese adulta mediada por circuitos neurais específicos é uma técnica valiosa com grande potencial para que as modificações estudem uma escala diversa de circuitos neural. O sucesso destes tipos de experimentos depende de vários fatores, incluindo a entrega viral exata, a sel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.J.Q. foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde mental dos institutos nacionais de saúde o suplemento de diversidade R01MH111773, bem como uma subvenção de formação T32 T32NS007431-20. Este projeto foi apoiado das concessões concedidas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160, e NS104530).

Materials

24 Well Plate Thermo Fisher Scientific 07-200-84
48 Well Plate Denville Scientific T1049
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) Carbosynth NE08701
Alcohol 70% Isopropyl Thermo Fisher Scientific 64-17-5
Alcohol Prep Pads Thermo Fisher Scientific 13-680-63
Alexa-488 Azide Thermo Fisher Scientific A10266
Anti-Chicken Nestin Aves NES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCX Santa Cruz Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2 Thermo Fisher Scientific 14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Solution (povidone-iodine) Amazon
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) Sigma-Aldrich 251275
Clozapine N- Oxide Sigma-Aldrich C08352-5MG
Confocal Software (Zen Black) Zeiss Microscopy Zen 2.3 SP1 FP1 (black)
Copper (II) Sulfate Pentahydrate Thermo Fisher Scientific AC197722500
Cotton Swabs Amazon
Coverslip Denville Scientific M1100-02
Delicate Task Wipe Kimwipes Kimtech Science 7557
Drill Bit .5mm Fine Science Tools 19007-05
Ethylene Glycol Thermo Fisher Scientific E178-1
Hamilton Needle 2 inch Hmailton Company 7803-05
Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN Hmailton Company Ref: 87931
High Speed Drill Foredom 1474
Infusion Pump Harvard Apparatus 70-4511
Injectable Saline Solution Mountainside Health Care NDC 0409-4888-20
Insulin Syringe BD Ultra-Fine Insulin Syringes
Isoflurane Henry Schein 29405
Stereotax For Small Animal KOPF Instruments Model 942
Leica M80 Leica
Leica Microtome Leica SM2010 R
LSM 780 Zeiss Microscopy
Nair (Hair Removal Product) Nair
Paraformaldahyde 4% Sigma-Aldrich 158127
Plus Charged Slide Denville Scientific M1021
Phosphate Buffered Solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20 slide unit Electron Microscopy Science 70312-24
Slide Rack holder Electron Microscopy Science 70312-25
Small Animal Heating Pad K&H
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Super PAP Pen 4 mm tip PolySciences 24230
Surgical Scalpel MedPride 47121
Tris Buffered Solution (TBS) Sigma-Aldrich T5912
Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) Sigma-Aldrich C8532
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Tweezers Amazon
Vet Bond Tissue Adhesive 3M 1469SB

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Quintanilla, L. J., Yeh, C., Bao, H., Catavero, C., Song, J. Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59237, doi:10.3791/59237 (2019).

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