O objetivo deste protocolo é descrever uma aproximação para analisar o comportamento de pilhas neurais adultas da haste/progenitor em resposta à manipulação chemogenetic de um circuito neural local específico.
A neurogênese adulta é um processo dinâmico pelo qual as células-tronco neurais recém-ativadas (NSCS) na zona zona (SGZ) do giro dentado (DG) geram novos neurônios, que se integram em um circuito neural existente e contribuem para funções hipocampais específicas . É importante ressaltar que a neurogênese adulta é altamente suscetível a estímulos ambientais, o que permite a regulação dependente da atividade de várias funções cognitivas. Uma vasta gama de circuitos neurais de várias regiões do cérebro orquestrates estas funções cognitivas complexas. Portanto, é importante entender como os circuitos neurais específicos regulam a neurogênese adulta. Aqui, nós descrevemos um protocolo para manipular a atividade do circuito neural usando o receptor do desenhador ativado exclusivamente pela tecnologia das drogas do desenhador (dreadds) que regula NSCS e o progênie recém-nascido nos roedores. Este protocolo detalhado inclui a injeção Stereotaxic de partículas virais, a estimulação chemogenetic de circuitos neural específicos, a administração análoga do timidina, o processamento do tecido, a rotulagem da imunofluorescência, a imagem latente confocal, e a imagem latente análise de vários estágios de células precursoras neurais. Este protocolo fornece instruções detalhadas sobre técnicas da recuperação do antígeno usadas para visualizar NSCS e seus progênie e descreve uma maneira simples, contudo eficaz de modular circuitos do cérebro usando o N-óxido do Clozapine (CNO) ou CNO-que contem a água bebendo e Vírus que expressam DREADDs. A força deste protocolo reside na sua adaptabilidade para estudar uma gama diversificada de circuitos neurais que influenciam a neurogênese adulta derivada de NSCs.
A neurogênese adulta é um processo biológico pelo qual novos neurônios nascem em um adulto e integrados nas redes neurais existentes1. Nos seres humanos, este processo ocorre no giro dentado (DG) do hipocampo, onde cerca de 1.400 novas células nascem a cada dia2. Estas células residem na parte interna da DG, que abriga um nicho neurogênico, denominado zona zona (SGZ). Aqui, células-tronco neurais adultas hipocampais (NSCs) passam por um processo complexo de desenvolvimento para se tornarem neurônios totalmente funcionais que contribuem para a regulação de funções cerebrais específicas, incluindo aprendizagem e memória, regulação do humor e resposta ao estresse3 ,4,5,6. Para influenciar comportamentos, os NSCs adultos são altamente regulados por vários estímulos externos de uma forma dependente da atividade, respondendo a uma variedade de pistas químicas locais e distais. Estas pistas químicas incluem neurotransmissores e Neuromoduladores e atuam em um circuito de maneira específica de várias regiões cerebrais. Importante, a convergência de circuito largo destes sinais químicos em NSCs permite o regulamento original e preciso da ativação, da diferenciação, e das decisões do Fate da pilha de haste.
Uma das maneiras mais eficazes de interrogar a regulação do circuito de NSCs adultos in vivo é através da análise de imunofluorescência de emparelhamento com manipulações de circuito largo. A análise da imunofluorescência de NSCs adultos é uma técnica comumente utilizada, onde os anticorpos contra marcadores moleculares específicos são usados para indicar o estágio de desenvolvimento de NSCs adultos. Estes marcadores incluem: Nestin como uma pilha radial do glia e um marcador neural adiantado do progenitor, Tbr2 como um marcador intermediário do progenitor, e DCX como um marcador do neuroblast e do neurônio imaturo7. Adicionalmente, através da administração de análogos da timidina como BrdU, Cidu, IDU e edu, as populações de células submetidas à fase S podem ser rotuladas individualmente e visualizadas8,9,10. Combinando essas duas abordagens, uma ampla gama de perguntas pode ser investigada, variando de como a proliferação é regulada em estágios específicos de desenvolvimento, a forma como várias pistas afetam a diferenciação de NSC e a neurogênese.
Existem várias opções para manipular eficazmente os circuitos neurais, incluindo a estimulação elétrica, optogenética e quimiogenética, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. A estimulação elétrica envolve uma cirurgia extensiva onde os elétrodos estão implantados a uma região específica do cérebro que sejam usadas mais tarde para transmitir sinais elétricos para modular uma região alvejada do cérebro. No entanto, esta abordagem carece de especificidade celular e de circuito. A optogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor ativado por luz que é estimulado por um laser emitido através de uma fibra óptica implantada, mas requer manipulações extensas, grande custo e cirurgias complexas11. A quimiogenética envolve a entrega de partículas virais que codificam um receptor de designer ativado exclusivamente por drogas de grife ou DREADDs, que são subsequentemente ativados por um ligador específico e biologicamente inerte conhecido como N-óxido de clozapina (CNO)12 . A vantagem de utilizar DREADDs para manipular circuitos neurais locais que regulam NSCs adultos reside na facilidade e várias rotas de administração CNO. Isto permite uma aproximação menos demorada com manipulação animal reduzida, que é facilmente adaptável para estudos a longo prazo para modular circuitos neural.
A aproximação descrita neste protocolo é uma coleção detalhada de vários protocolos exigidos para interrogar com sucesso a regulação do circuito da neurogênese hippocampal adulta que combina técnicas da imunofluorescência e manipulações do circuito usando a quimiogenética. O método descrito no seguinte protocolo é apropriado para estimular ou inibir um ou vários circuitos simultaneamente in vivo para determinar sua função reguladora na neurogênese adulta. Essa abordagem é melhor usada se a pergunta não precisar de um alto grau de resolução temporal. As perguntas que exigem o controle temporal preciso da estimulação/inibição em uma determinada freqüência, podem melhor ser endereçadas usando o optogenetics13,14. A aproximação descrita aqui é adaptada facilmente para estudos a longo prazo com manipulação animal mínima especial onde o stress é uma preocupação principal.
O objetivo deste protocolo é avaliar como manipular circuitos neurais específicos regula a neurogênese hipocampal adulta in vivo usando uma série de técnicas immunohistochemistry. O Regulamento dependente da atividade de assaying da neurogênese adulta mediada por circuitos neurais específicos é uma técnica valiosa com grande potencial para que as modificações estudem uma escala diversa de circuitos neural. O sucesso destes tipos de experimentos depende de vários fatores, incluindo a entrega viral exata, a sel…
The authors have nothing to disclose.
L.J.Q. foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde mental dos institutos nacionais de saúde o suplemento de diversidade R01MH111773, bem como uma subvenção de formação T32 T32NS007431-20. Este projeto foi apoiado das concessões concedidas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160, e NS104530).
24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
Cotton Swabs | Amazon | ||
Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
Leica M80 | Leica | ||
Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
Small Animal Heating Pad | K&H | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
Tweezers | Amazon | ||
Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |