Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.
Abstract
נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך דינמי שבו הופעל לאחרונה תאי גזע עצביים (NSCs) באזור תת-החוליות (sgz) של פיתול כישור מבית (DG) ליצור נוירונים חדשים, אשר משתלבים לתוך המעגל העצבי הקיים ולתרום פונקציות היפוקאמאל ספציפיים . חשוב מכך, נוירוגנזה מבוגרת היא רגישה מאוד לגירויים סביבתיים, המאפשרת רגולציה תלוית הפעילות של פונקציות קוגניטיביות שונות. מגוון רחב של מעגלים עצביים מאזורי מוח שונים מתזמרים פונקציות קוגניטיביות מורכבות אלה. לכן חשוב להבין כיצד מעגלים עצביים ספציפיים לווסת נוירוגנזה למבוגרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתמרן פעילות המעגל העצבי באמצעות קולטן מעצב מופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) טכנולוגיה המסדיר NSCs ו צאצאי היילוד במכרסמים. פרוטוקול מקיף זה כולל הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים, גירוי גנטי כימוע של מעגלים עצביים ספציפיים, מינהל אנלוגי של תימידין, עיבוד רקמות, מimmunofluorescence תיוג, הדמיה מיקוד, והדמיה ניתוח של בשלבים שונים של תאים מקודמי העצבי. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות על טכניקות אחזור אנטיגן המשמש להמחיש NSCs וצאצהם ומתאר פשוט, דרך יעילה עדיין לווסת את מעגלי המוח באמצעות קלוזאפין N-תחמוצת (cno) או cno-המכיל מי שתייה ו וירוסים בהבעת הדרדים. החוזק של פרוטוקול זה טמון ביכולת הסתגלות שלה ללמוד מגוון רחב של מעגלים עצביים המשפיעים על נוירוגנזה מבוגרת נגזר מ NSCs.
Introduction
נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך ביולוגי שדרכו הנוירונים החדשים נולדים במבוגר ומשולבים לתוך הרשתות העצביות הקיימות1. בבני אדם, תהליך זה מתרחש בפיתול הדנאט (DG) של ההיפוקמפוס, שם כ-1,400 תאים חדשים נולדים כל יום2. תאים אלה נמצאים בחלק הפנימי של ה-DG, אשר הנמלים נישה נוירוגניים, כינה את האזור התת בגרגרים (SGZ). כאן, תאי גזע עצביים מבוגרים (NSCs) עוברים תהליך התפתחותי מורכב כדי להפוך נוירונים תפקודית לחלוטין כי לתרום לוויסות של פונקציות המוח ספציפיים, כולל למידה וזיכרון, רגולציה מצב הרוח, ואת תגובת הלחץ3 ,4,5,6. כדי להשפיע על התנהגויות, מבוגר NSCs מוסדר ביותר על ידי גירויים חיצוניים שונים באופן התלוי בפעילות על ידי תגובה למערך של רמזים מקומיים וכימיים. הסימנים הכימיים הללו כוללים נוירוטרנסמיטורים ונוירומודולטורים ופועלים באופן מעגלי מאזורי מוח שונים. חשוב מכך, התכנסות מעגל רחב של רמזים כימיים אלה על NSCs מאפשר רגולציה ייחודית ומדויקת של הפעלת תא גזע, בידול, והחלטות הגורל.
אחת הדרכים האפקטיביות ביותר לחקור את הרגולציה בוויסות של NSCs למבוגרים בvivo היא על ידי שיוך ניתוח מערכתית של מניפולציות במעגל רחב. Immunofluorescence ניתוח של למבוגרים NSCs היא טכניקה מנוצל בדרך כלל, שבו נוגדנים נגד סמנים מולקולריים ספציפיים משמשים כדי לציין את השלב ההתפתחותי של למבוגרים NSCs. סמנים אלה כוללים: nestin כמו תא הרדיאלי של גליה וסמן קדמון מוקדם של העצב, Tbr2 כסמן מחולל קדמון ביניים, ו dcx כמו הסמן הישן והלא בוגר תא מטרה7. בנוסף, על-ידי ניהול האנלוגיות של תימידין כגון brdu, cidu, idu, ו-Edu, אוכלוסיות תאים שעברו שלב S יכול להיות מתויג בנפרד ודמיינו8,9,10. על-ידי שילוב שתי הגישות הללו, ניתן לחקור מגוון רחב של שאלות החל מאופן ההפצה המוסדר בשלבים התפתחותיים ספציפיים, לגבי האופן שבו סימנים שונים משפיעים על בידול המועצה לבטחון לאומי ועל נוירוגנזה.
מספר אפשרויות קיימות כדי לטפל ביעילות במעגלים עצביים כולל גירוי חשמלי, אלקטרואופטיקה, וכימוסגנטיקה, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם. גירוי חשמלי כרוך בניתוח נרחב שבו אלקטרודות מושתלים לאזור המוח מסוים אשר משמשים מאוחר יותר כדי לשדר אותות חשמליים לווסת את אזור המוח המיועד. עם זאת, גישה זו חסרה גם הסלולר וגם המעגלים. אלקטרואופטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים לקודד קולטן המופעל אור כי הוא מגורה על ידי לייזר הנפלט באמצעות סיבים אופטיים מושתל, אבל דורש מניפולציות נרחבות, עלות גדולה, ניתוחים מורכבים11. כימוקוטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים המקודדים קולטן מעצב המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים או ראסטות, אשר מופעלים לאחר מכן על ידי מסוים ומבחינה ביולוגית המכונה קלוזאפין N-תחמוצת (cno)12 . היתרון של ניצול ראסטות לתמרן מעגלים עצביים מקומיים המסדירים למבוגרים NSCs שקרים בקלות ומסלולים שונים של הממשל CNO. זה מאפשר גישה פחות זמן רב עם טיפול בעלי חיים מופחתת, אשר ניתנת להתאמה בקלות למחקרים ארוכי טווח לווסת את המעגלים העצביים.
הגישה המתוארת בפרוטוקול זה היא אוסף מקיף של פרוטוקולים שונים הנדרשים לחקור בהצלחה את הרגולציה של היפוקמאל נוירוגנזה למבוגרים המשלבת הן שיטות immunofluorescence ומניפולציות מעגלים באמצעות כימוטיקה. השיטה המתוארת בפרוטוקול הבא מתאימה לעירור או לעיכוב של מעגלים אחד או מספר בו בvivo כדי לקבוע את התפקוד הרגולטורי שלהם על נוירוגנזה מבוגרת. גישה זו משמשת במידה הטובה ביותר אם השאלה אינה זקוקה לרזולוציה גבוהה של הזמן. שאלות הדורשות שליטה טמפורלית מדויקת של גירוי/עיכוב בתדר מסוים, יכולה להיות ממוענת טוב יותר באמצעות אלקטרואופטיקה13,14. הגישה המתוארת כאן מותאמת בקלות למחקרים ארוכי טווח עם טיפול בבעלי חיים מינימלי במיוחד כאשר המתח הוא דאגה עיקרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך כיצד מניפולציה מעגלים עצביים ספציפיים מסדיר נוירוגנזה היפוקאמאל למבוגרים בvivo באמצעות סדרה של טכניקות אימונוהיסטוכימיה. שיטה התלויה בוויסות הפעילות של בוגרים נוירוגנזה באמצעות מעגלים עצביים ספציפיים היא טכניקה רבת ערך עם פוטנציאל רב לשינויים לחקר מגוון ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. היה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת התוספת גיוון R01MH111773, כמו גם מענק הכשרה T32 T32NS007431-20. פרויקט זה נתמך ממענקים הוענק ל-י. ס. י. מ-NIH (MH111773, AG058160, ו NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
