Isolamento di cellule rigenerative di derivazione adiposa per il trattamento della disfunzione erettile a seguito di prostatectomia radicale

Tutti i metodi descritti nel protocollo sono stati approvati dal Comitato etico nazionale danese (n. 37054), dall’Autorità danese per la salute e i medicinali (numero EUDRA-CT 2013-004220-11) e dall’Agenzia danese per la protezione dei dati (2008-58-0035). Lo studio è stato registrato presso ClinicalTrials.gov (NCT02240823). Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki monitorata dall’unità di buona pratica clinica (GCP) dell’ospedale universitario di Odense. La preparazione dell’ADRC è stata effettuata in uno stabilimento dei tessuti autorizzato per la manipolazione di tessuti e cellule umani presso l’ospedale universitario di Odense (Autorità danese per la salute e i medicinali, autorizzazione n. 29035). 1. Reclutamento del paziente/partecipante Per partecipare allo studio reclutare pazienti che soddisfino i seguenti criteri di inclusione. Reclutare pazienti di età superiore ai 18 anni, sessualmente attivi prima della RP e non infettati dalle malattie sessualmente trasmissibili, ad esempio l’infezione da virus dell’immunodeficienza umana, la sifilide o l’epatite. Assicurarsi che soffrano di disfunzione erettile dopo una RP che è stata eseguita a causa del cancro alla prostata.NOTA: In questo studio, i pazienti sono stati arruolati nello studio 5-18 mesi dopo la RP e sono stati inclusi indipendentemente dal metodo chirurgico: aperto / robotico assistito o nervesparing / non nervesparing. Assicurarsi che il valore dell’antigene prostatico specifico (PSA) non dovesse essere rilevabile al follow-up clinico dopo la RP. Assicurarsi che i pazienti fossero sessualmente attivi prima della RP e che esprimessero ancora il desiderio di rimanere sessualmente attivi dopo la RP. Assicurarsi che l’intervento farmacologico con un inibitore della fosfodiesterasi di tipo 5 (inibitore della PDE5 ) o un analogo sintetico della prostaglandina E1 (PGE1) sia stato provato prima di partecipare e ritenuto insufficiente. Inoltre, assicurarsi che i pazienti abbiano abbastanza grasso sottocutaneo sull’addome o sulla coscia. Escludere i pazienti dallo studio, se ci sono stati eventi gravi in anestesia durante la RP o se sono stati trattati con anticoagulanti. 2. Liposuzione NOTA: La liposuzione è un’operazione che rimuove il grasso o i lipociti dall’area sottocutanea. Questa parte del protocollo viene eseguita come una liposuzione standard e la procedura viene eseguita in condizioni sterili in una sala operatoria. Tutti gli strumenti utilizzati nell’ambito della procedura devono essere sterili e il chirurgo deve indossare scrub, camice chirurgico sterile, guanti sterili, maschera chirurgica e cappello. Anestetizzare il paziente. Assicurarsi che il paziente sia in anestesia generale durante la procedura e questa parte venga eseguita da un anestesista. Disinfettare la pelle dell’addome e dello scroto con clorexidina 0,5% (spirito di clorhexidina, 96% di clorexidina digluconato medicato con etanolo 77% W/W = 83% v/v). Utilizzare un marcatore chirurgico per disegnare le aree sull’addome in cui verrà eseguita la liposuzione. L’area di solito sarà l’area tra la sinfisi e l’ombelico. Fai due incisioni larghe 6 mm nella pelle dell’addome con un bisturi (numero 11). Posizionare le incisioni simmetricamente e lateralmente dall’area di risalita della liposuzione. Metti un po ‘di lubrificante come la vaselina sulle incisioni, per assicurarti che la cannula di infiltrazione scivoli dentro e fuori dalle incisioni facilmente durante la liposuzione. Introdurre una cannula di infiltrazione di dimensioni 14 G attraverso le incisioni nella pelle. Iniettare la soluzione di Kleins modificata per via sottocutanea nelle aree contrassegnate parallelamente alla superficie cutanea. Iniettare così tanta soluzione che il tessuto bersaglio diventa gonfio e sodo, o tumescente.NOTA: La soluzione di Kleins modificata è costituita da una soluzione di 1.000 mL di lattato di Ringers e 1 mg di adrenalina (epinefrina (1:1.000.000)). Non ass anestesia locale alla soluzione, in quanto potrebbe avere un impatto negativo sugli ADRC. Iniettare un volume di soluzione di Kleins modificata che corrisponde al rapporto 1:1 con il tessuto adiposo. Attendere 10 minuti per massimizzare l’effetto dell’adrenalina e ridurre la quantità di sangue nel tessuto adiposo raccolto. Eseguire una liposuzione standard utilizzando una liposuzione a infusione a getto per raccogliere 200-300 ml di tessuto adiposo. Utilizzare cannule smussate che sono cave, a cui sono integrati un tubo di infusione e un ugello. Collegare la cannula a un dispositivo di aspirazione per la liposuzione.NOTA: Un’infusione continua di acqua a forma di ventaglio scioglie il tessuto adiposo in frammenti che possono essere facilmente aspirati attraverso l’apertura nella cannula. Introdurre una siringa da 3 mm con una punta smussata attraverso le incisioni sull’addome Raccogliere il tessuto adiposo in un lipo-collettore per preservare il lipoaspirato in un ambiente sterile. Il lipoaspirato inizierà a separarsi dalla fase acquosa. Utilizzare siringhe sterili da 50 ml per aspirare il lipoaspirato dal lipo-collettore. Ridurre al minimo il volume di acqua aspirata nelle siringhe e avvitare un tappo sulla punta delle siringhe per mantenere sterile il tessuto adiposo. Posizionare le siringhe con la punta verso il basso in un sacchetto di plastica sterile per iniziare la separazione del lipoaspirato dalla fase acquosa. Mettere il sacchetto in un contenitore sterile ancora con le punte rivolte verso il basso per continuare la separazione. Coprire il contenitore con un drappo sterile per fissare l’ambiente sterile durante il trasporto.NOTA: Secondo il manuale d’uso della macchina utilizzata per l’isolamento, il lipoaspirato può essere conservato fino ad un massimo di 4 ore prima dell’isolamento degli ADRC, tuttavia, lo elaboriamo sempre immediatamente. Chiudere le incisioni cutanee con il materiale di sutura preferito dai chirurghi. Posizionare un indumento compressivo, un legante addominale, intorno all’addome per ridurre l’edema postoperatorio. Fare un blocco del pene iniettando 20 mL di bupivacaina 5 mg/mL contenenti 5 μg di adrenalina. Utilizzare una siringa da 20 ml e applicare con un ago da 23 G, lungo 1 1/4 di pollice. Applicare 5 ml di bupivacaina in ogni quadrante del sottocute. Iniettare la bupivacaina in due siti, uno posto ventralmente l’altro dorsalmente. Introdurre l’ago in tutta la sua lunghezza nel tessuto sottocutaneo puntando l’ago lateralmente a destra e iniettare l’anestesia mentre l’ago viene retratto. Ripetere l’iniezione puntando l’ago a sinistra.NOTA: Il paziente può ora essere svegliato dall’anestesia generale dall’anestesista. 3. Isolamento degli ADRC NOTA: Il processo di isolamento degli ADRC viene eseguito come descritto in dettaglio nel manuale utente che segue il dispositivo (vedere Tabella dei materiali). È importante che la procedura venga eseguita in condizioni sterili per garantire che il lipoaspirato non sia esposto a contaminanti durante la purificazione degli ADRC. Il tempo necessario per l’isolamento degli ADRC dipende dal volume di lipoaspirato, ma l’intera procedura richiederà circa 2,5 ore utilizzando il dispositivo semiautomatico come descritto qui. Posizionare tutti i materiali di consumo e gli enzimi in modo asettico su un tavolo coperto da un asciugamano chirurgico monouso sterile.NOTA: un kit di procedure contiene tutti i materiali di consumo e gli enzimi necessari per l’isolamento degli ADRC da un paziente. Oltre a questo, devono essere disponibili tre sacche per infusione da 37-39 °C da un litro di suonerie lattate insieme a indumenti sterili, guanti e asciugamani ed etanolo per la disinfezione. Annotare tutti i numeri di lotto di materiali di consumo ed enzimi e anche la temperatura delle suonerie lattate, quando collegate al sistema. Pulire il dispositivo con etanolo e seguendo le istruzioni del produttore Caricare il set di materiali di consumo sul dispositivo e collegare un sacchetto di suonerie lattate al sistema. Eseguire la serie di test semiautomatici (controllo del sistema e test di tenuta) prima di aggiungere il lipoaspirato. Lasciare riposare il lipoaspirato in tubi da 50 ml mentre vengono eseguiti i passaggi in 3.1. Ciò consentirà al grasso di separarsi dalla fase liquida. Annotare la quantità totale (in ml) di tessuto adiposo e utilizzarla per assicurarsi che la quantità di grasso caricato sia nell’intervallo della capacità del dispositivo. Caricare il tessuto quando richiesto dal dispositivo. La macchina ora scaricherà il liquido in eccesso e peserà la quantità di tessuto adiposo caricato prima di essere lavato con suonerie lattate. Quando il tessuto è stato lavato e drenato di nuovo, collegare una nuova sacca per infusione con suonerie lattate a 37-39 °C quando richiesto dalla macchina. Ricostituire l’enzima disponibile in commercio contenente collagenasi e proteasi in 5 mL lattato Ringers (una fiala di enzima è sufficiente per quantità di grasso fino a 270 ml). Assicurarsi che il dispositivo visualizzi la quantità di enzima (in base al peso del tessuto) da iniettare nel contenitore con il tessuto adiposo. Una volta iniettata, la digestione enzimatica che viene effettuata sotto agitazione durerà circa 20 minuti. Dopo la digestione dei tessuti, lasciare che l’agitatore si fermi e controllare che il contenuto sia separato in due fasi: una fase gialla contenente lipidi superiori e uno strato rosa inferiore che contiene gli ADRC. Lasciare che quest’ultimo strato venga drenato nella camera di elaborazione cellulare (che va nella centrifuga incorporata nel dispositivo) del set di materiali di consumo, lasciando lo strato lipidico dietro. Lasciare che gli ADRC si concentrino nella camera di lavorazione cellulare durante più cicli di centrifugazione. Ora aggiungi 10 ml di Intravase (contiene DNasi, che aiuta ad evitare l’aggregazione nella sospensione finale ad ADRC) ricostituita in Suonerie lattate. La reazione enzimatica dura 10 minuti dopo di che gli ADRC vengono lavati.NOTA: questo passaggio è completamente automatico e la macchina informerà al termine del processo. Quando l’isolamento degli ARDRC è completato, risospese le cellule in 5 mL di Ringer Lactate. Aspirare la soluzione in una siringa da 5 ml. Montare un Luer-lock femmina a 3 vie sulla siringa da 5 mL contenente gli ADRC e aspirare 4 mL di DRDC in un’altra siringa sterile da 5 mL. Trasferire gli ultimi 1 mL in una siringa da 1 mL. Utilizzare questo 1 mL per la caratterizzazione ADRC, ad esempio, conteggio cellulare, vitalità cellulare, analisi dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso e capacità di differenziazione ADRC. Indossare un ago da 25 G sulla siringa da 5 mL contenente i 4 mL di ADRC prima di essere confezionato in un drappo sterile. Utilizzare gli ADRC per iniezione nel ricevente. In questo caso, la soluzione di ADRC conterrà in media 8,4-32,7 milioni di celle. 4. Impianto degli ADRC nei corpi cavernosi NOTA: Questa è una procedura sterile. Tutti gli strumenti devono essere sterili e la persona che inietta la soluzione contenente le cellule staminali nei corpi cavernosi deve indossare guanti sterili. Il paziente è sveglio durante questa procedura e riceverà le proprie cellule staminali. Gli ADRC vengono iniettati senza contare le cellule prima dell’iniezione. Mantenere omogenea la soluzione di DRRC inclinando delicatamente la siringa fino a quando non viene iniettata nei corpi cavernosi. Posiziona un drappo di apertura sopra il pene. Posizionare un laccio emostatico alla radice del pene utilizzando un anello di vaso in silicone. Stringere il cappio e fissarlo con pinze curve pean. Rendere il laccio emostatico abbastanza stretto da fermare il flusso di sangue dal pene. Utilizzare due scambi antisettici per disinfettare la pelle del pene nel sito di iniezione (sito laterale dei corpi cavernosi). Iniettare 1 mL della soluzione contenente ADDRC, in un angolo diretto nei corpi cavernosi sul lato destro in due punti diversi, ripetere questo passaggio in seguito nel cavernoso dei corpi sinistro. Il volume totale degli ARDRC iniettati è di 4 ml. Attendere 30 minuti e quindi rimuovere il laccio emostatico. Dimettere il paziente dopo 2 ore di osservazione dopo l’iniezione di ADRCs, per garantire che il paziente sia ben recuperato dopo l’anestesia. 5. Cura postoperatoria Raccomandare al paziente di non fare alcuna prestazione fisica che possa aumentare la pressione sanguigna entro la prima settimana, per prevenire lo sviluppo di ematomi. Raccomandare al paziente di indossare il legante addominale per 24 ore i primi 14 giorni dopo l’intervento chirurgico e successivamente per 14 giorni durante il giorno. Trattare il dolore postchirurgico con paracetamolo orale (ad esempio, paracetamolo; 1.000 mg, 4 volte al giorno) e antinfiammatorio orale (ad esempio, ibuprofene; 400 mg 3 volte al giorno).