Aislamiento de células regenerativas derivadas de tejido adiposo para el tratamiento de la disfunción eréctil después de la prostatectomía radical

Todos los métodos descritos en el protocolo fueron aprobados por el Comité Nacional de Ética de Dinamarca (No. 37054), la Autoridad Danesa de Salud y Medicamentos (número EUDRA-CT 2013-004220-11) y la Agencia Danesa de Protección de Datos (2008-58-0035). El estudio se registró en ClinicalTrials.gov (NCT02240823). El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki monitoreada por la unidad de Buenas Prácticas Clínicas (GCP) del Hospital Universitario de Odense. La preparación de ADRC se llevó a cabo en un establecimiento autorizado de tejidos para el manejo de tejidos y células humanas en el Hospital Universitario de Odense (Autoridad Danesa de Salud y Medicamentos, Autorización n.º 29035). 1. Reclutamiento de pacientes/participantes Para participar en el ensayo, reclute pacientes que cumplan los siguientes criterios de inclusión. Reclutar pacientes mayores de 18 años, sexualmente activos antes de la RP y no infectados con las enfermedades de transmisión sexual, por ejemplo, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, sífilis o hepatitis. Asegúrese de que sufren de disfunción eréctil después de una RP que se realizó debido al cáncer de próstata.NOTA: En este estudio, los pacientes se inscribieron en el estudio 5-18 meses después de la RP y se incluyeron independientemente del método de cirugía: abierto / asistido por robot o de búsqueda nerviosa / no nerviosa. Asegurar que el valor del antígeno prostático específico (PSA) tenía que ser indetectable en el seguimiento clínico después de la RP. Asegúrese de que los pacientes fueran sexualmente activos antes de la RP, y aún expresando su deseo de permanecer sexualmente activos después de la RP. Asegúrese de que la intervención farmacológica con un inhibidor de la fosfodiesterasa tipo 5 (inhibidor de la PDE5 ) o un análogo sintético de la prostaglandina E1 (PGE1) se ha intentado antes de participar y se considera insuficiente. Además, asegúrese de que los pacientes tengan suficiente grasa subcutánea en el abdomen o el muslo. Excluir a los pacientes del ensayo, si hubo eventos graves bajo la anestesia durante la RP o si fueron tratados con anticoagulantes. 2. Liposucción NOTA: La liposucción es una operación que elimina la grasa o los lipocitos de la zona subcutánea. Esta parte del protocolo se realiza como una liposucción estándar y el procedimiento se realiza en condiciones estériles en un quirófano. Todos los instrumentos utilizados durante el procedimiento deben ser estériles y el cirujano debe usar exfoliantes, bata quirúrgica estéril, guantes estériles, máscara quirúrgica y sombrero. Anestesiar al paciente. Asegúrese de que el paciente esté bajo anestesia general durante el procedimiento, y esta parte es realizada por un anestesiólogo. Desinfectar la piel del abdomen y el escroto con clorhexidina 0.5% (aguardiente de clorhexidina, 96% de digluconato de clorhexidina medicado con etanol 77% W/W = 83% v/v). Utilice un marcador quirúrgico para dibujar las áreas en el abdomen donde se realizará la liposucción. El área generalmente será el área entre la sínfisis y el ombligo. Haga dos incisiones de 6 mm de ancho en la piel del abdomen con un bisturí (número 11). Coloque las incisiones simétrica y lateralmente desde el área hacia arriba de la liposucción. Ponga un poco de lubricante como vaselina en las incisiones, para asegurarse de que la cánula de infiltración se deslice dentro y fuera de las incisiones fácilmente durante la liposucción. Introducir una cánula de infiltración tamaño 14 G a través de las incisiones en la piel. Inyecte la solución modificada de Kleins por vía subcutánea en las áreas marcadas paralelas a la superficie de la piel. Inyecte tanto de la solución que el tejido objetivo se vuelva hinchado y firme, o tumescente.NOTA: La solución de Kleins modificada consiste en una solución de 1.000 ml de lactato de Ringers y 1 mg de adrenalina (epinefrina (1:1.000.000)). No aplique anestesia local a la solución, ya que puede tener un impacto negativo en los ADRC. Inyecte un volumen de solución de Kleins modificada que corresponda a la proporción 1:1 con respecto al tejido adiposo. Espere 10 minutos para maximizar el efecto de la adrenalina y reducir la cantidad de sangre en el tejido adiposo recolectado. Realice una liposucción estándar utilizando una liposucción de infusión a chorro para cosechar 200-300 ml de tejido adiposo. Use cánulas romas que sean huecas, a las que se integran un tubo de infusión y una boquilla. Conecte la cánula a un dispositivo de succión para la liposucción.NOTA: Una infusión continua de agua en forma de abanico afloja el tejido graso en fragmentos que se pueden succionar fácilmente a través de la abertura en la cánula. Introducir una jeringa de 3 mm con una punta roma a través de las incisiones en el abdomen Recoger el tejido adiposo en un lipo-colector para preservar el lipoaspirado en un ambiente estéril. El lipoaspirado comenzará a separarse de la fase acuática. Use jeringas estériles de 50 ml para succionar el lipoaspirado del lipocolector. Minimice el volumen de agua aspirada en las jeringas y atornille un tapón en la punta de las jeringas para mantener el tejido adiposo estéril. Coloque las jeringas con la punta hacia abajo en una bolsa de plástico estéril para iniciar la separación del lipoaspirado de la fase acuosa. Coloque la bolsa en un recipiente estéril aún con las puntas hacia abajo para continuar la separación. Cubra el recipiente con una cortina estéril para asegurar el ambiente estéril durante el transporte.NOTA: De acuerdo con el manual de usuario de la máquina utilizada para el aislamiento, el lipoaspirado se puede almacenar hasta un máximo de 4 h antes del aislamiento de los ADRC, sin embargo, siempre lo procesamos de inmediato. Cierre las incisiones de la piel con el material de sutura preferido por los cirujanos. Coloque una prenda de compresión, un aglutinante abdominal, alrededor del abdomen para reducir el edema postoperatorio. Haga un bloqueo del pene inyectando 20 ml de bupivacaína 5 mg / ml que contenga 5 μg de adrenalina. Use una jeringa de 20 ml y aplíquela con una aguja de 23 G, de 1 1/4 de pulgada de largo. Aplicar 5 ml de bupivacaína en cada cuadrante del subcutis. Inyecte la bupivacaína en dos sitios, uno colocado ventralmente y el otro dorsalmente. Introduzca la aguja en toda su longitud en el tejido subcutáneo apuntando la aguja lateralmente hacia la derecha e inyecte la anestesia a medida que la aguja se retrae. Repita la inyección apuntando la aguja hacia la izquierda.NOTA: El paciente ahora puede ser despertado de la anestesia general por el anestesiólogo. 3. Aislamiento de los ADRC NOTA: El proceso de aislamiento de los ADRC se realiza como se describe en detalle en el manual del usuario después del dispositivo (consulte la Tabla de materiales). Es importante que el procedimiento se realice en condiciones estériles para garantizar que el lipoaspirado no esté expuesto a ningún contaminante durante la purificación de los ADRC. El tiempo necesario para el aislamiento de los ADRC depende del volumen de lipoaspiración, pero todo el procedimiento durará aproximadamente 2,5 h utilizando el dispositivo semiautomático como se describe aquí. Coloque todos los consumibles y enzimas asépticamente sobre una mesa cubierta por una toalla quirúrgica desechable estéril.NOTA: Un kit de procedimiento contiene todos los consumibles y enzimas necesarios para el aislamiento de ADRC de un paciente. Además de esto, tres bolsas de infusión de 37-39 ° C, de un litro de Ringers lactados deben estar disponibles junto con ropa estéril, guantes y toallas y etanol para la desinfección. Anote todos los números de lote de consumibles y enzimas y también la temperatura de los Ringers Lactated, cuando se conectan al sistema. Limpie el dispositivo con etanol y siga las instrucciones del fabricante Cargue el conjunto de consumibles en el dispositivo y conecte una bolsa de Ringers Lactated al sistema. Realice la serie de pruebas semiautomáticas (comprobación del sistema y prueba de fugas) antes de añadir el lipoaspirado. Deje reposar el lipoaspirado en tubos de 50 ml mientras se realizan los pasos en 3.1. Esto permitirá que la grasa se separe de la fase líquida. Anote la cantidad total (en ml) de tejido graso y úselo para asegurarse de que la cantidad de grasa cargada esté en el rango de capacidad del dispositivo. Cargue el tejido cuando el dispositivo se lo solicite. La máquina ahora drenará el exceso de líquido y pesará la cantidad de tejido graso cargado antes de lavarlo con ringers lactados. Cuando el pañuelo se haya lavado y drenado de nuevo, conecte una nueva bolsa de infusión con timbres lactados de 37-39 °C cuando la máquina lo solicite. Reconstituir la enzima disponible comercialmente que contiene la mezcla de colagenasa y proteasa en anillos lactados de 5 ml (un vial de enzima es suficiente para cantidades de grasa de hasta 270 ml). Asegúrese de que el dispositivo muestre la cantidad de enzima (basada en el peso del tejido) para inyectar en el recipiente con el tejido graso. Una vez inyectada, la digestión enzimática que se lleva a cabo bajo agitación durará alrededor de 20 min. Después de la digestión del tejido, deje que el agitador se detenga y verifique que el contenido esté separado en dos fases: una fase amarilla que contiene lípidos superiores y una capa rosa inferior que contiene los ADRC. Deje que esta última capa drene en la cámara de procesamiento celular (que entra en la centrífuga incorporada del dispositivo) del conjunto de consumibles, mientras deja atrás la capa lipídica. Deje que los ADRC se concentren en la cámara de procesamiento celular durante múltiples rondas de centrifugación. Ahora agregue 10 ml de Intravase (contiene DNasa, que ayuda a evitar la aglomeración en la suspensión final de ADRC) reconstituida en Lactated Ringers. La reacción enzimática dura 10 minutos después de lo cual se lavan los ADRC.NOTA: Este paso es totalmente automático y la máquina informará cuando finalice el proceso. Cuando se complete el aislamiento de los ADRC, resuspender las células en 5 ml de ringer lactato. Aspire la solución en una jeringa de 5 ml. Monte una llave de paso luer-lock hembra de 3 vías en la jeringa de 5 ml que contiene los ADRC, y aspire 4 ml de ADRC en otra jeringa estéril de 5 ml. Transfiera el último 1 ml a una jeringa de 1 ml. Utilice este 1 ml para la caracterización de ADRC, por ejemplo, recuento de células, viabilidad celular, análisis de marcadores de superficie por citometría de flujo y capacidad de diferenciación de ADRC. Coloque una aguja de 25 G en la jeringa de 5 ml que contiene los 4 ml de ADRC antes de envasarla en una cortina estéril. Use los ADRC para inyección en el receptor. En este caso, la solución de ADRC contendrá en promedio 8.4-32.7 millones de células. 4. Implantación de los ADRC en cuerpos cavernosos NOTA: Este es un procedimiento estéril. Todos los instrumentos deben ser estériles, y la persona que inyecta la solución que contiene las células madre en los cuerpos cavernosos debe usar guantes estériles. El paciente está despierto durante este procedimiento y recibirá sus propias células madre. Los ADRC se inyectan sin contar las células antes de la inyección. Mantenga la solución de EDRC homogénea inclinando la jeringa suavemente hasta que se inyecte en los cuerpos cavernosos. Coloque una cortina de apertura sobre el pene. Coloque un torniquete en la raíz del pene mediante el uso de un lazo de vaso de silicona. Apriete el lazo y asegúrelo con pinzas curvas de guisante. Haga que el torniquete sea lo suficientemente apretado como para detener el flujo sanguíneo del pene. Use dos intercambios antisépticos para desinfectar la piel del pene en el sitio de inyección (sitio lateral de los cuerpos cavernosos). Inyecte 1 ml de la solución que contiene ADRC, en un ángulo directo en los cuerpos cavernosos del lado derecho en dos lugares diferentes, repita este paso después en el cuerpo cavernoso izquierdo. El volumen total de ADRC inyectados es de 4 ml. Espere 30 minutos y luego retire el torniquete. Dar de alta al paciente después de 2 h de observación después de la inyección de ADRC, para asegurar que el paciente esté bien recuperado después de la anestesia. 5. Cuidados postoperatorios Recomendar al paciente que no realice ningún rendimiento físico que pueda elevar la presión arterial dentro de la primera semana, para prevenir el desarrollo de hematomas. Recomendar al paciente que use el aglutinante abdominal durante 24 h los primeros 14 días después de la cirugía y en lo sucesivo durante 14 días durante el día. Tratar el dolor posquirúrgico con paracetamol oral (p. ej., paracetamol; 1.000 mg, 4 veces al día) y antiinflamatorio oral (p. ej., ibuprofeno; 400 mg 3 veces al día).