Выделение регенеративных клеток жирового происхождения для лечения эректильной дисфункции после радикальной простатэктомии

Все методы, описанные в протоколе, были одобрены Датским национальным комитетом по этике (No 37054), Датским управлением здравоохранения и лекарственных средств (EUDRA-CT No 2013-004220-11) и Датским агентством по защите данных (2008-58-0035). Исследование было зарегистрировано в ClinicalTrials.gov (NCT02240823). Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией, контролируемой отделением надлежащей клинической практики (GCP) в университетской больнице Оденсе. Подготовка ADRC проводилась в уполномоченном тканевом учреждении для обработки тканей и клеток человека в университетской больнице Оденсе (Датское управление здравоохранения и лекарственных средств, разрешение No 29035). 1. Подбор пациента/участников Для участия в исследовании набирают пациентов, которые соответствуют следующим критериям включения. Набирать пациентов старше 18 лет, сексуально активных до РП и не инфицированных заболеваниями, передающимися половым путем, например, вирусной инфекцией иммунодефицита человека, сифилисом или гепатитом. Убедитесь, что они страдают от эректильной дисфункции после РП, которая была выполнена из-за рака предстательной железы.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании пациенты были включены в исследование через 5-18 месяцев после RP и были включены независимо от метода операции: открытый / роботизированный или нервный / не нервирующий. Убедитесь, что значение простат-специфического антигена (ПСА) должно быть неопределяемым при клиническом наблюдении после РП. Следите за тем, чтобы пациенты были сексуально активны до РП, и все еще выражали желание оставаться сексуально активными после РП. Убедитесь, что фармакологическое вмешательство с ингибитором фосфодиэстеразы типа 5 (ингибитор ФДЭ5 ) или синтетическим аналогом простагландина Е1 (PGE1) было опробовано до участия и признано недостаточным. Кроме того, убедитесь, что у пациентов достаточно подкожного жира на животе или бедре. Исключить пациентов из исследования, если во время РП наблюдались тяжелые явления под наркозом или если их лечили антикоагулянтами. 2. Липосакция ПРИМЕЧАНИЕ: Липосакция – это операция, которая удаляет жир или липоциты из подкожной области. Эта часть протокола выполняется как стандартная липосакция и процедура выполняется в стерильных условиях в операционной. Все инструменты, используемые в рамках процедуры, должны быть стерильными, и хирург должен носить скрабы, стерильный хирургический халат, стерильные перчатки, хирургическую маску и шляпу. Обезболивают больного. Убедитесь, что пациент находится под общим наркозом во время процедуры, и эта часть выполняется анестезиологом. Дезинфекция кожи живота и мошонки хлоргексидином 0,5% (спирт клоргексидина, 96% этанола, лекарственного хлоргексидина диглюконата 77% мас./Вт = 83% v/v). Используйте хирургический маркер, чтобы нарисовать области на животе, где будет выполнена липосакция. Область обычно будет областью между симфизом и пупком. Сделайте два разреза шириной 6 мм в коже живота скальпелем (no 11). Поместите разрезы симметрично и сбоку от отведенной области липосакции. Нанесите немного смазки такого вазелина на разрезы, чтобы убедиться, что инфильтрационная канюля легко скользит в и из разрезов во время липосакции. Вводят инфильтрацию размером 14 г канюли через разрезы в коже. Вводят модифицированный раствор Кляйнса подкожно в отмеченные участки, параллельные поверхности кожи. Вводите так много раствора, что целевая ткань становится опухшей и твердой или тумесцентной.ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированный раствор Kleins состоит из раствора 1000 мл лактата Ringers и 1 мг адреналина (адреналин (1:1 000 000)). Не следует применять местную анестезию к раствору, так как это может оказать негативное влияние на АДПК. Вводят объем модифицированного раствора Кляйнса, соответствующий соотношению 1:1 к жировой ткани. Подождите 10 мин, чтобы максимизировать эффект адреналина и уменьшить количество крови в собранной жировой ткани. Выполните стандартную липосакцию с использованием струйной инфузионной липосакции для сбора 200-300 мл жировой ткани. Используйте тупые канюли, которые являются полыми, к которым интегрированы инфузионная трубка и насадка. Прикрепите канюлю к всасывающему устройству для липосакции.ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывная веерообразная инфузия воды разрыхляет жировую ткань на фрагменты, которые можно легко отсасывать через отверстие в канюле. Ввести шприц 3 мм тупым кончиком через разрезы на животе Соберите жировую ткань в липоколлектор, чтобы сохранить липоаспират в стерильной среде. Липоаспират начнет отделяться от водной фазы. Используйте 50 мл стерильных шприцев, чтобы всасывать липоаспират из липоколлектора. Сведите к минимуму объем воды, всасываемой в шприцы, и прикрутите заглушку на кончике шприцев, чтобы сохранить жировую ткань стерильной. Поместите шприцы кончиком вниз в стерильный полиэтиленовый пакет, чтобы начать отделение липоаспирата от водной фазы. Поместите мешок в стерильный контейнер с наконечниками, обращенными вниз, чтобы продолжить разделение. Накройте контейнер стерильной драпировкой для защиты стерильной среды во время транспортировки.ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно руководству пользователя машины, используемой для изоляции, липоаспират может храниться максимум до 4 часов до изоляции ADRC, однако мы всегда обрабатываем его немедленно. Закройте разрезы кожи предпочтительным для хирургов шовным материалом. Поместите компрессионное белье, абдоминальное связующее, вокруг живота, чтобы уменьшить послеоперационный отек. Сделайте блок полового члена, введя 20 мл бупивакаина 5 мг/мл, содержащего 5 мкг адреналина. Используйте шприц объемом 20 мл и нанесите иглой весом 23 г длиной 1 1/4 дюйма. Применяют по 5 мл бупивакаина в каждый квадрант в подкожной клетчатке. Вводят бупивакаин в два места, один из которых помещается вентрально, а другой дорсально. Введите иглу по всей ее длине в подкожную клетчатку, направив иглу латерально вправо и введите анестезию по мере втягивания иглы. Повторите инъекцию, направив иглу влево.ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь пациент может быть разбужен от общей анестезии анестезиологом. 3. Изоляция ADRC ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс изоляции АДПК выполняется так, как подробно описано в руководстве пользователя после устройства (см. Таблицу материалов). Важно, чтобы процедура проводилась в стерильных условиях, чтобы гарантировать, что липоаспират не подвергается воздействию каких-либо загрязнений во время очистки АДПК. Время, затрачиваемое на выделение АДПК, зависит от объема липоаспирата, но вся процедура займет примерно 2,5 ч с использованием полуавтоматического устройства, как описано здесь. Поместите все расходные материалы и ферменты на стол, покрытый стерильным одноразовым хирургическим полотенцем.ПРИМЕЧАНИЕ: Процедурный набор содержит все необходимые расходные материалы и ферменты, необходимые для выделения АДПК от одного пациента. Кроме того, три 37-39 ° C, однолитровой инфузионный пакет Lactated Ringers должны быть доступны вместе со стерильной одеждой, перчатками и полотенцами и этанолом для дезинфекции. Запишите все партии расходных материалов и ферментов, а также температуру lactated Ringers при подключении к системе. Протрите устройство этанолом и следуйте инструкциям производителя Загрузите комплект расходных материалов на устройство и подключите к системе мешок с звонарями lactated Ringers. Выполните серию полуавтоматических тестов (проверка системы и проверка на герметичность) перед добавлением липоаспирата. Дайте липоаспирату постоять в пробирках по 50 мл, пока выполняются шаги в 3.1. Это позволит жиру отделиться от жидкой фазы. Запишите общее количество (в мл) жировой ткани и используйте его, чтобы убедиться, что количество загруженного жира будет находиться в диапазоне емкости устройства. Загрузите ткань при появлении соответствующего запроса от устройства. Теперь машина будет сливать лишнюю жидкость и взвешивать количество жировой ткани, загруженной перед стиркой с помощью lactated Ringers. Когда ткань будет вымыта и снова слита, подключите новый инфузионный мешок с 37-39 °C Lactated Ringers по запросу машины. Восстановите коммерчески доступный фермент, содержащий смесь коллагеназы и протеазы, в 5 мл Lactated Ringers (одного флакона фермента достаточно для жировых количеств до 270 мл). Убедитесь, что устройство отображает количество фермента (в зависимости от веса ткани) для введения в канистру с жировой тканью. После инъекции ферментативное пищеварение, которое проводится при перемешивании, будет длиться около 20 минут. После переваривания тканей пусть мешалка остановится и проверит, что содержимое разделено на две фазы: верхнюю липидсодержащую желтую фазу и нижний розовый слой, содержащий АДПК. Пусть последний слой стекает в камеру обработки ячеек (которая входит во встроенное в устройство центрифугу) расходного набора, оставляя при этом липидный слой позади. Пусть АДПК концентрируются в камере обработки клеток во время нескольких раундов центрифугирования. Теперь добавьте 10 мл интравазы (содержит ДНКазу, которая помогает избежать слипания в конечной суспензии ADRC), восстановленной в лактированных звонарях. Ферментативная реакция длится в течение 10 мин, после чего АДПК промывают.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг полностью автоматизирован, и машина сообщит, когда процесс будет завершен. Когда выделение АДПК завершено, повторно суспендируют клетки в 5 мл лактата Рингера. Аспирируйте раствор в шприц объемом 5 мл. Установите 3-позиционный запорный кран женского luer-lock на шприц 5 мл, содержащий ADRCs, и аспирируйте 4 мл ADRC в другой стерильный шприц объемом 5 мл. Переведите последний 1 мл в шприц объемом 1 мл. Используйте этот 1 мл для характеристики ADRC, например, количества клеток, жизнеспособности клеток, анализа поверхностных маркеров с помощью проточной цитометрии и способности дифференцировки ADRC. Наденьте иглу 25 г на шприц объемом 5 мл, содержащий 4 мл ADRC, прежде чем он будет упакован в стерильную драпировку. Используйте ADRC для инъекции в реципиента. При этом раствор АДПК будет в среднем содержать 8,4-32,7 млн клеток. 4. Имплантация АДПК в кавернозные тела ПРИМЕЧАНИЕ: Это стерильная процедура. Все инструменты должны быть стерильными, а человек, вводящий раствор, содержащий стволовые клетки, в кавернозные тела, должен носить стерильные перчатки. Пациент бодрствует во время этой процедуры и получит собственные стволовые клетки. АДПК вводят без подсчета клеток перед инъекцией. Держите раствор АДОК однородным, осторожно наклоняя шприц до тех пор, пока он не будет введен в кавернозные тела. Поместите драпировку отверстия над пенисом. Поместите жгут на корень пениса, используя силиконовую петлю сосуда. Затяните петлю и закрепите ее щипцами изогнутого пена. Сделайте жгут достаточно плотным, чтобы остановить приток крови из пениса. Используйте два антисептических свопа для дезинфекции кожи полового члена в месте инъекции (боковой участок кавернозных тел). Вводят 1 мл раствора, содержащего АДПК, под прямым углом в кавернозные тела с правой стороны в двух разных местах, затем повторите этот шаг в левом кавернозном теле. Общий объем вводимых АДГП составляет 4 мл. Подождите 30 минут, а затем снимите жгут. Выписать пациента после 2 ч наблюдения после инъекции АДПК, чтобы убедиться, что пациент хорошо выздоровел после анестезии. 5. Послеоперационный уход Рекомендуют пациенту не делать никаких физических работ, которые могут поднять артериальное давление в течение первой недели, чтобы предотвратить развитие гематом. Рекомендуется пациенту носить абдоминальное связующее в течение 24 ч в течение первых 14 дней после операции и в дальнейшем в течение 14 дней в дневное время. Лечить послеоперационную боль пероральным ацетаминофеном (например, парацетамол; 1000 мг, 4 раза в день) и пероральным противовоспалительным (например, ибупрофен; 400 мг 3 раза в день).