בידוד של תאים רגנרטיביים שמקורם בשומן לטיפול בבעיות זיקפה בעקבות כריתת ערמונית רדיקלית
Summary
גילוי מדויק של שיטות ופרוטוקולים הוא חיוני לקליטה בקנה מידה גדול של טיפולים בתאי גזע. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד תאים רגנרטיביים שמקורם בשומן, המשמשים להזרקה תוך-תאית אחת כטיפול בבעיות זיקפה (ED) בעקבות כריתת ערמונית רדיקלית (RP).
Abstract
תאי גזע משמשים בתחומי מחקר רבים ברפואה רגנרטיבית, בין השאר משום שטיפולים אלה יכולים להיות מרפאים ולא סימפטומטיים. ניתן לקבל תאי גזע מרקמות שונות ותוארו מספר שיטות לבידוד. השיטה המוצגת לבידוד של תאים רגנרטיביים שמקורם בשומן (ADRCs) יכולה לשמש בתחומים טיפוליים רבים מכיוון שהשיטה היא הליך כללי, ולכן אינה מוגבלת לטיפול בבעיות זיקפה (ED). ED היא תופעת לוואי נפוצה וחמורה לכריתת ערמונית רדיקלית (RP) שכן ED לעתים קרובות אינו מטופל היטב עם טיפול קונבנציונלי. השימוש ב-ADRC’s כטיפול ב-ED עורר עניין רב בשל התוצאות החיוביות הראשוניות לאחר הזרקה אחת של תאים לתוך הקורפורה cavernosum. השיטה המשמשת לבידוד של ADRC’s היא תהליך פשוט, אוטומטי, הניתן לשחזור ומבטיח מוצר אחיד. יתר על כן, העקרות של המוצר המבודד מובטחת מכיוון שהתהליך כולו מתרחש במערכת סגורה. חשוב למזער את הסיכון לזיהום וזיהום מכיוון שתאי הגזע משמשים להזרקה בבני אדם. ההליך כולו יכול להיעשות תוך 2.5-3.5 שעות ואינו דורש מעבדה מסווגת אשר מבטלת את הצורך במשלוח רקמות לאתר מחוץ לאתר. עם זאת, להליך יש כמה מגבלות שכן הכמות המינימלית של lipoaspirate מנוקז עבור מכשיר הבידוד לתפקד היא 100 גרם.
Introduction
לתאי גזע יש את היכולת להתמיין לסוגי תאים שונים, והם מפרישים גורמי פרקרין שנחשבים כמעודדים את תהליך הריפוי ברקמה פגומה 1,2,3,4. הם, אם כן, אטרקטיביים בתחום הרפואה הרגנרטיבית, משום שהם יכולים לייצג טיפול מרפא אפשרי.
כריתת ערמונית רדיקלית (RP) היא הטיפול המרפא הזהוב לחולים עם סרטן ערמונית מקומי בסיכון נמוך/בינוני ותוחלת חיים > 10 שנים. מטרת הניתוח היא מיגור הסרטן, אך יש לו מספר תופעות לוואי. השכיחות של בריחת שתן לאחר כריתת ערמונית נעה בין 2-60% ותפקוד לקוי של זיקפה (ED) נחווה על ידי 20-90% מהמטופלים5. טכניקה חוסכת עצבים היא אופציה אצל חלק מהחולים (ציון גליסון < 7, סיכון נמוך למחלה חוץ-קפסולרית)5. טכניקה זו חוסכת את העצבים האחראים על הזקפה, אך למרות שזה אפשרי, חולים רבים עדיין מדווחים על ED לאחר הניתוח.
אפשרויות הטיפול בשיקום הפין לאחר RP מורכבות בעיקר מטיפול במעכבי PDE-5, טיפול בהזרקה או החדרה ומשאבות ואקום. תרופות המשמשות לשיקום הפין נבדלות זו מזו מבחינה פרמקולוגית, אך מנגנון הפעולה שלהן כולל הרפיה של תאי השריר החלקים במערות קורפוס. עם זאת, מטופלים רבים חווים כישלון טיפולי ולעולם אינם משיגים השפעה של התרופה המאפשרת קיום יחסי מין6.
ה- ED המתרחש לאחר RP נחשב כנובע משינויים בלתי הפיכים מבחינה מבנית7. שינויים אלה מתרחשים ברקמת המערה וכוללים אפופטוזיס של תאי השריר והאנדותל החלקים ופיברוזיס. מנגנון הוונו-חסימתי האחראי על חלק מרכזי של הזקפה, נפגע על ידי השינויים, וכתוצאה מכך מילוי וקשיות גרועים יותר של הפין7.
רבים מהמטופלים מדווחים כי ל-ED שהם חווים יש השפעה שלילית על איכות חייהם8. הם אינם מוכנים לוותר על פעילותם המינית לאחר הניתוח, ולכן, טיפול מרפא עבור ED הוא אטרקטיבי, כאשר הטיפולים הזמינים האחרים לשיקום הפין נכשלים.
בניסויים קודמים, כולל ניסויים בבעלי חיים ובפאזה 1 קטנה בבני אדם, תאי גזע הראו תוצאות מבטיחות כטיפול חלופי ל-2,9,10,11,12 ED. התוצאות מראות כי בטוח להשתמש ב- ADRCs, וכי תפקוד הזיקפה משופר באופן משמעותי לאחר הזרקה אחת לתוך קורפורה cavernosum 2,9,10,11,12. תאים רגנרטיביים שמקורם בשומן (ADRCs) נחשבים כתומכים בהתחדשות הרקמה על ידי מנגנוני פאראקרין באמצעות שחרור הורמונים מרובים, גורמי גדילה נוירוטרופיים ואחרים, ציטוקינים ואולי גם מיקרו-רנ”א13. בנוסף, ADRCs מסוגלים להתמיין למספר סוגי תאים בוגרים כולל תאי שריר אנדותל וכלי דם, תאי סחוס, אוסטוציטים ונוירונים14,15. תכונות אלה הופכות את תאי הגזע למעניינים לפיתוח טיפול חדש וקבוע עבור ED.
תאי גזע מחולקים למספר קבוצות, בעצם אלה שמקורן בעובר המוקדם (תאי גזע עובריים) ואלה מרקמה בוגרת (תאי גזע בוגרים). תאי גזע בוגרים כוללים תאי גזע מזנכימליים (MSC) שהם מולטיפוטנטיים וניתן למצוא אותם במח העצם, ברקמת השומן, בדם טבורי, בשליה ובמוך שיניים17.
קל לגשת לתאי גזע מרקמת השומן, בניגוד לתאי גזע שמקורם במח העצם. קצירת תאי גזע ממח עצם היא הליך מסוכן וכואב בהשוואה לשאיבת שומן. מספר התאים שניתן יהיה לקצור ממח העצם יהיה מוגבל, בעוד שרק מחסני רקמת השומן של המטופל קובעים את הגבול למספר התאים שניתן לקצור. ניתן, אם כן, לבודד כמות גדולה של תאי גזע מרקמת השומן ללא צורך לאחר מכן לתרבית את התאים כדי לקבל כמות משביעת רצון. התאים הרגנרטיביים שמקורם בשומן, המכונים לעתים קרובות גם שבר כלי הדם הסטרומלי (SFV), מורכבים מסוגי תאים רבים, כולל MSCs, תאי אנדותל, פריקטים, תאי מערכת החיסון ואבותאבותיהם 18. כל אלה עשויים למלא תפקיד בתהליך ההתחדשות.
מטרת המחקר הנוכחי היא לחקור את ההשפעה של תאי גזע על ED לאחר RP על ידי שימוש ב-4 מ”ל של ADRCs אוטולוגיים שבודדו מרקמת שומן שזה עתה נקטפה לאחר הזרקה לתוך קורפורה cavernosum.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך המוצג לבידוד ADRCs אינו מוגבל לשימוש רק לטיפול ב- ED, אלא ניתן להשתמש בו בצורות רבות אחרות של טיפול וניסויים. הניסוי שלנו הראה כי ADRCs אוטולוגיים ומבודדים טריים בטוחים לשימוש, והטיפול נסבל היטב במעקב של 12 חודשים.
לפני השימוש בהליך יש כמה שיקולים שיש לעשות. החיסרון של הליך זה הוא כי המטופל חייב להיות תחת הרדמה כללית במהלך שאיבת שומן. ניתן לבצע שאיבת שומן בהרדמה מקומית, אך ניסוי קודם הראה כי שילוב של הרדמה מקומית ואדרנלין עשוי להשפיע לרעה על צמיחת התאים של פיברובלסטים20. הסיכון להיות תחת הרדמה כללית הוא בדרך כלל נמוך, אבל תוצאה שלילית עדיין נראה. יש לקחת בחשבון סיכון זה כאשר המטופלים נבחרים לטיפול. שאיבת שומן היא הליך כירורגי ולכן תמיד תישא בסיכון לסיבוכים. כמו בכל ההליכים הכירורגיים האחרים, קיים סיכון לדימום לאחר הניתוח וכתוצאה מכך להיווצרות המטומות וסיכון לזיהום. חלק מהמטופלים שלנו דיווחו גם על רגישות מופחתת חולפת של עור הבטן. סיבוך מיידי לשאיבת שומן הוא דימום. זה ידוע כי חולים מסתכנים מקבלים סיבוכים מערכתיים כאשר כמויות גדולות של רקמה מוסרת. שאיבת השומן בהליך זה הייתה קטנה יחסית ולכן לא נחשבה לגורם סיכון.
סיבוכים להזרקת תאים מדווחים כאדמומיות חולפת, רגישות והמטומות.
ההתקן המשמש לבידוד של ה- ADRCs, נבחר מכיוון שהמערכת מאושרת על ידי CE. בדנמרק, חובה להשתמש בציוד שאושר על ידי CE מכיוון שהרשויות מסווגות טיפול בתאי גזע כניסוי לבדיקת סמים, כאשר ה- ADRC משמש להזרקה בבני אדם.
למכשיר יש יתרונות כגון שכל ההליך מתוקנן ומבוצע בסביבה סטרילית סגורה ללא צורך במעבדה מסווגת ביותר. הסיכון לזיהום הוא, אם כן, מופחת. זה מבטיח כי ההליך הוא אחיד וניתן לשחזור, וכי איכות המוצר הסופי הוא תמיד זהה בכל פעם (עם זאת, זה גם תלוי באיכות של רקמת קלט). ביצוע הבידוד במכשיר הוא קל ואינו דורש מפעילים משכילים במיוחד.
מגבלה אחת של המכשיר היא שהקלט המינימלי למכונה הוא 100 גרם ליפואספיראט מרוקן. מכיוון ששאיבת שומן מסתיימת לחלוטין לפני תחילת עיבוד התא (ובמקרה שלנו, במיקום אחר, לא ב- OR) מניסיוננו, זה ידרוש שכמות lipoaspirate תהיה לפחות 125 מ”ל באמצעות המדידה הגסה של מזרקי 50 מ”ל. אחרת יש סיכון שלא יהיה מספיק חומר למכונה להמשיך איתו. כמו כן, שימוש במגבלת הקצה העליונה (הקלט המרבי הוא 425 מ”ל) יגרום להליך בידוד ארוך מאוד.
נראה כי לתאי גזע בוגרים הן מרקמת השומן והן ממח העצם יש יכולת להתחדשות עצמית והתמיינות כמו תאי גזע עובריים. אחד היתרונות של ADRCs על פני תאי גזע המופואיטיים הוא תפוקה גבוהה פי 100-500 לכל נפח רקמה בהשוואה למח עצם21,22, ולכן, ADRCs אינם צריכים להיות בתרבית. יתר על כן, תאי גזע המופואיטיים קשים וכואבים יותר לקטיף מהחולה מאשר רקמת שומן. במצבים רבים, רקמת השומן היא רק מוצר פסולת לאחר הניתוח. ניתן תרבית תאי גזע כדי לתת תשואה גבוהה יותר המתאימה לאנגיוגנזה, אולם ל-ADRC’s המבודדים הטריים עשוי להיות פוטנציאל אנגיוגני גבוה יותר מאשרלתרבית 23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נוסדה על ידי בית החולים האוניברסיטאי אודנזה (11/31936), המרכז הדני לרפואה רגנרטיבית (14/50427) והאגודה הדנית לסרטן.
Materials
| Liposuction | |||
| Abdominal Binder | Dale | Size depent of the patient | |
| Adhessive OP-towel | Mölnlycke Health Care | 906677 | 90×75 cm |
| Adrenalin 1 mg/ml | Amgros I/s | 74 44 23 | 1 ml |
| Basic OP supplies | Mölnlycke Health Care | 97010873-07 | |
| Carbon Steel blade 11 | Swann-Morton | ||
| Chlorhixidine Ethanol | Faarborg Pharma | 5% colored | |
| Disposable set Lipocollector 3 | Human Med | 670200 | |
| Extension hoses | Extrudan | 5.8/8.3 mm, Ch 25, 3,5 M long | |
| Gaze Rags | Barrier | 175201 | 30×45 cm |
| Jelonet | Smith and Nephew Medical Ltd | 90509225 | 10 x 10 cm |
| Marcaine 5 mg/ml + Adrenaline 5 micrigram | Astra Zeneca | 20 mL | |
| Mesorb Bandage | Mölnlycke Health Care | 677001 | 10×13 cm |
| Microlance | Becton Dickinson | 304622 | 18 G + 23 G |
| Monocryl suture | Ethicon | 04:00 | |
| Ringer-lactat | Fresinus Kabi | ||
| Sterile gloves | Gammex | 330052065 | |
| Surgical Gown | Mölnlycke Health Care | 690103-01 | |
| Surgical Marker | Richard-Allan | ||
| Surgical Mask | 3M | ||
| Syringe | Codan Medical | 6,28,402 | 50/60 ml cath tip |
| Syringe | Becton Dickinson | 700016181 | 1 ml |
| WAL- Applikator for cannulae 25/30 cm | Human Med | REF 500001 | |
| Isolation of ADRC's | |||
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson | REF 303172 | |
| 3 way stopcock | One Med | REF 10554-01 | |
| Adhesive OP-towel | Mölnlycke Health Care AB | REF 906677 | 90×75 cm |
| Cytori Celution 800IV device | Cytori | ||
| Desinfection swaps | Mediq Danmark | 3340010 | |
| Microlance | Becton Dickinson | 25G (0,5*25 mm) | |
| Nitril Gloves | Abena | Powder free | |
| OR drape Sheet, 2 layers | Lohmann & Rauscher | REF 33005 | |
| Ringers Lactate | Fresinus Kabi | 06756 (DK) | |
| Sterile gloves | |||
| Sterile gown | |||
| Supplemental kit for Cytori Celution 800IV devise | Cytori | ||
| Termometer | Thomas Scientific | traceable | |
| Injection of ADRC's | |||
| Aperture drape | One Med | REF1565-01 | 75*90 cm |
| Desinfection swap | Mediq Danmark | 3340010 | |
| Pean | Leibinger | 32-01257 | |
| Silicone Vessel Loop | Purple Surgical | REF PS3203 | |
| Sterile gloves | Sempermed | Or Use your favorite |
References
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regenerative Medicine. 5 (1), 121-143 (2010).
- Albersen, M., et al. Injections of adipose tissue-derived stem cells and stem cell lysate improve recovery of erectile function in a rat model of cavernous nerve injury. The Journal of Sexual Medicine. 7 (10), 3331-3340 (2010).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Yang, J., et al. Adipose-derived stem cells improve erectile function partially through the secretion of IGF-1, bFGF and VEGF in aged rats. Andrology. 6, 498-509 (2018).
- Phillippou, Y. A., et al. Penile rehabilitation for postprostatectomy erectile dysfunction. Cochrane Database Systematic Review Issue 10. 012414, (2018).
- Nelson, C. J., et al. Back to baseline: erectile function recovery after radical prostatectomy from the patients’ perspective. Journal of Sex Medicine. 10, 1636-1643 (2013).
- Fode, M., Ohl, D. A., Ralph, D., Sonksen, J. Penile rehabilitation after radical prostatectomy: what the evidence really says. British Journal of Urology International. 112 (7), 998-1008 (2013).
- Johansson, E., et al. Long-term quality-of-life outcomes after radical prostatectomy or watchfull waiting: the Scandinavian Prostate Cancer Group-4 randomised trail. Lancet Oncology. 12, 891-899 (2011).
- Huang, Y. C., et al. The effect of intracavernous injection of adipose tissue-derived stem cells on hyperlipidemia-associated erectile dysfunction in a rat model. The Journal of Sexual Medicine. 7 (4), 1391-1400 (2010).
- Garcia, M. M., et al. Treatment of erectile dysfunction in the obese type 2 diabetic ZDF rat with adipose tissue-derived stem cells. The Journal of Sexual Medicine. 7 (1), 89-98 (2010).
- Lin, C. S., Xin, Z., Dai, J., Huang, Y. C., Lue, T. F. Stem-cell therapy for erectile dysfunction. Expert Opinion on Biological Therapy. 13 (11), 1585-1597 (2013).
- Haahr, M. K., et al. Safety and Potential Effect of a Single Intracavernous Injection of Autologous Adipose-Derived Regenerative Cells in Patients with Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy: An Open-Label Phase I Clinical Trial. EBioMedicine. 5, 204-210 (2016).
- Mirotsou, M., Jayawardena, T. M., Schmeckpebper, J., Gnecchi, M., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms of stem cell reparative and regenerative actions in the heart. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 50 (2), 280-289 (2011).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regenerative Medicine. 5 (1), 121-143 (2010).
- Albersen, M., et al. Injections of adipose tissue-derived stem cells and stem cell lysate improve recovery of erectile function in a rat model of cavernous nerve injury. The Journal of Sexual Medicine. 7 (10), 3331-3340 (2010).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Gokce, A., Peak, T. C., Abdel-Mageed, A. B., Hellstrom, W. J. Adipose Tissue-Derived Stem Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction. Current Urology Reports. 17, 14 (2016).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and cultured expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Frederation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherpy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Haahr, M. K., et al. A 12-month Follow-up after a Single Intracavernous Injection of Autologous Adipose-derived Regenerative Cells in Patients with Erectile Dysfunction following Radical Prostatectomy: An Open-label Phase 1 Clinical Trial. Urology. 121, 203 (2018).
- Fedder, C., et al. In vitro exposure of human fibroblasts to local anesthetics impairs cell growth. Clinical & Experimental Immunology. 162 (2), 280-288 (2010).
- D’Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine ad tissue banking. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
- Zhang, S., et al. Comparison of the therapeutic effects of human and mouse adipose-derived stem cells in a murine model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury. Stem Cell Research and Therapy. 4 (1), 13 (2013).
- Yusuke, H., et al. Transplantation of freshly isolated adipose tissue-derived regenerative cells enhances angiogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Biomedical Research. 34 (1), 23-29 (2013).
