Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化

1. ナノ粒子プローブの作製 注: このアッセイでは、ニュートラポリマー (AV) と共有結合されている官能化ゴールドナノロッド (AuNRs の直径 x 71 nm の長さ) と、DFM で赤 (641 nm ピーク) の散乱信号を生成する表面プラズモン共鳴ピークがあります。照明。 遠心分離および吸引 (10 分間の4° c で 8500 x g) による200μ l の PBS (pH 7.0) で AuNR (2.56 x 10 11 粒子) を3回40洗浄し、続いて AuNR-AV ペレットが懸濁される最終遠心分離および吸引ステップPBS に40μ l を加えた。 対象のエキソソームサブタイプと PBS の150μ l の表面の抗原に特異的な10μ l のビオチン化抗体 (0.5 mg/mL) でこの AuNR 懸濁液を混合し、4° c で2時間混合し、ミキサーを使用してニュートラ-ビオチン結合を完了させます。 得られた抗体共役 AuNRs (AuNR) を遠心分離と吸引 (10 分間は4° c で 6500 x g ) で3回洗浄し、200μ l の PBS で懸濁し、使用まで4° c で保存します。注: 滅菌技術および短い貯蔵時間は、AuNR-IgG の汚染および分解を避けるために使用する必要があります。それは、それらのコンジュゲーションの24時間以内に抗体共役 AuNRs を使用するのが最善です。 2. EV キャプチャスライドの作成 希釈したエキソソームは、PBS で 0.025 mg/mL の抗体を捕捉し、この希釈液をマルチウェルプロテイン A/G スライド上に1μ l/ウェルを加え、このスライドを加湿されたチャンバ内の37° c でインキュベートし、タンパク質 A/G に固定化された抗体結合を可能にします。スライド。 未結合抗体を除去するために井戸を吸引し、PBS の1μ l/ウェルの添加と吸引によってウェルを3回洗浄し、その後、1μ l のブロッキングバッファー (材料の表を参照) で各ウェルを負荷し、加湿されたチャンバ内の37° c で2時間スライドをインキュベートします。残りのタンパク質結合部位をロックします。 ブロッキングバッファーを除去するためにウェルを吸引し、PBS の1μ l/ウェルの添加および吸引によってウェルを3回洗浄し、ブロックされたスライドを直ちに使用してエキソソームを捕捉および分析する。 3. 標準曲線の準備 特定のエキソソームサブタイプの絶対的または相対的な存在量を正確に定量化するために、ユーザは、目的のエキソソーム表面バイオマーカーを均一に発現する純粋なエキソソーム集団を有する標準曲線を生成しなければならない。本研究は、膵癌期と予後6,18との関係が報告されている転移関連膜タンパク質、エフリン A2 受容体を発現するエキソソームの存在量を分析する。注: ヒト膵臓がん細胞株 PANC およびそのエキソソームは、このタンパク質を発現することが知られており、この細胞株から単離されたエキソソームを、複雑なエキソソームにおいてこのタンパク質を発現するエキソソームの数を定量化する標準曲線を生成するために使用したサンプル。 無血清培地中で37° c で48時間培養細胞を培地中にエキソソーム蓄積させ、次いで、付着細胞培養から培養培地の懸濁培養または直接吸引の遠心分離によって細胞培養上清を単離する。 2000 x gで回収した培地を30分間遠心し、残骸を除去し、上清を回復させる。 適切な容量の0.45 μ m 低タンパク質結合フィルタユニット (例えば 250 mL polyethersulfone 真空濾過ユニット) を通して、清澄化された培養上清を濾過する。 得られた濾液を、10万の公称分子量制限フィルタシステムを用いて 3200 x gで遠心分離することによって、250μ l の最終体積に濃縮する。このフィルターから保持された容積を集め、200μ l の PBS でフィルターを洗浄し、集められたエキソソームのサンプル容積とこの洗浄容積を結合しなさい。 このサンプルを45分間、21000 x gで遠心分離して慎重に上澄み液を回収し、沈殿した物質を収集しないように注意してください。 回収した上清を 10万 x gで3時間遠心し、エキソソームを沈殿させる。上澄みを吸引し、エキソソームペレットを100μ l の PBS で回収します。 得られたエキソソーム懸濁液は、24時間以内に使用した場合は4° c、長期保管の場合は-80 ° c で保管してください。注: 凍結融解サイクルを繰り返すためにエキソソームサンプルを対象としないでください。 エキソソーム数の直接測定によって混合後のエキソソーム懸濁液のアリコートを定量化する (例えば、ナノ粒子追跡分析またはチューナブル抵抗パルスセンシングによる、またはマイクロ bicinchoninic によるエキソソームライセートのタンパク質濃度を測定することによって酸アッセイ、または同等の方法、エキソソーム量に近似する手段として)16、19。 エキソソーム懸濁液の連続希釈のセットを生成して、ナノ粒子シグナルのエキソソーム数またはタンパク質含量の比較を可能にする。 各エキソソーム標準の1μ l を、アッセイプレート上の各複製ウェルに移します。注: 標準曲線は、ナノ粒子シグナルとエキソソーム濃度の間の相関線の傾きを計算するために使用することができ、(1) アッセイ性能を評価し、(2) 実験サンプル中の標的エキソソームの相対濃度を決定する。 4. ヒト血漿または血清サンプルの処理 標準的な方法によって血しょうまたは血清のサンプルを集め、エキソソームの分析のために必要とされるまで-80 ° c で貯える。室温の水浴でサンプルを急速に解凍します。融解したサンプルを繰り返し混ぜて均質懸濁液を促進する。注: 血清および血漿サンプルからの結果は、凝固反応中にエキソソームの有意な放出があるため、同等ではない可能性がある。 血漿または血清サンプルを15分間 500 x g で遠心分離し、タンパク質凝集体およびその他の破片を沈殿させます。血漿または血清サンプルのアリコートを新鮮なチューブに移し、PBS を加えて1:1 希釈を生成する。希釈したサンプルを、適宜、穏やかなボルテックスまたは反転によって混ぜる。各血漿または血清懸濁液の1μ l をアッセイプレート上のそれぞれの複製ウェルに移す。 5. エキソソームの捕捉と検出 ブロックされた EV キャプチャーの負荷ウェルは、エキソソームサンプルの1μ l/ウェルを使用して、サンプルあたり8回の反復を用いて、加湿チャンバ内の4° c で一晩中スライドをインキュベートします。すべてのサンプルウェルを吸引し、PBS の1μ l/ウェルを加えて井戸を洗浄し、未結合のエキソソームおよびその他の汚染物質をロードされたエキソソームサンプルから除去します。 前もって調製された AuNR 懸濁液の1μ l を使用してサンプルウェルを負荷し (上記の第1項を参照)、加湿チャンバ内で37° c で2時間スライドをインキュベートします。ナノ粒子溶液を吸引し、PBS 中のスライドをミキサーを使用して10分間 0.01% トゥイーンスパン (PBST) で補充し、回転ミキサーを使用して10分間、すべてのサンプルウェルを脱イオン水で洗浄し、その後の LMDFM 画像に対して空気乾燥します。注: アッセイ間の変動係数 (Cv) は、同じサンプルの8回の反復から評価されます。Cv > 20% を示すサンプルは、情報がないと見なされ、十分なサンプルがある場合は繰り返す必要があります。 6. DFM イメージキャプチャ ダークフィールドコンデンサー (1.2 < NA < 1.4) を搭載した顕微鏡に接続されたデジタルカメラと 1/220 s の露光時間を採用した4倍の対物レンズを使用して、一貫した照明下でのエキソソーム定量の画像をキャプチャします。 イメージキャプチャソフトウェアを開きます。注: 以下に説明するプロトコルの NIS 要素顕微鏡イメージングソフトウェア (資料の表を参照) を使用しますが、そのイメージキャプチャパラメータと一致する別のソフトウェアを使用することは可能です。NIS 要素ビューアーイメージングソフトウェアは、分析、視覚化、およびアーカイブツールを含む画像ファイルとデータセットを表示するための無料のスタンドアロンプログラムです。以下のパラメータはオートフォーカスを備えた顕微鏡用でもあり、複数の画像を自動的にキャプチャして単一の画像にステッチすることを可能にする自動化ステージもあります。 スライドを顕微鏡の段階に逆さまに置き、スライドの位置を調整し、コンデンサーレンズがスライドに接触するスライドの背部に液浸オイルの小さい低下を加える。 ソフトウェアインターフェイスの [ライブ] ボタンをクリックし、高濃度の標準ウェルに対して露光時間を調整して、画像が飽和していないことを確認します。 [取得] タブから [大容量画像をスキャン] ウィンドウを開き、ソフトウェアインターフェイスのパラメータを次のように設定します。マクロイメージオプティカル conf = current;目的: 2: 10x、走査光 conf = 現在、目標: 2: 10x。ステッチオーバーラップ= 20%;Via = 最適なパスをステッチします。 大きい画像の作成を選択し、ステージの移動中にアクティブなシャッターを閉じ、各キャプチャの前に待機します:20 ミリ秒、開始時に手動でフォーカスし、 20 フィールドごとにステップバイステップのフォーカスを使用します。これらの設定は、スキャンした画像と一緒に保存されます。 [顕微鏡] ステージを移動して、ターゲットスキャンフィールドの左上右下の下限を定義します。モニター上の鮮明な画像を実現するためにフォーカスを調整し、必要に応じてコンデンサー設定と環境照明を調整して、フォーカスされた画像内の照明の不規則性を最小限に抑えます。 ソフトウェアのイメージ出力ファイルに名前を付けます。スキャンボタンをクリックして、顕微鏡がスキャンし、作成し、スライド全体のステッチ画像を保存することができます。 使用している画像キャプチャソフトウェアで保存した画像を開き、ImageJ の DSM プラグインでのその後の解析のために1/8 スケールで保存します。 7. DFM 画像解析 ImageJ プログラム (https://imagej.nih.gov/ij/) をダウンロードします。Https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually に記載されている手順を使用して、DSM アルゴリズムプラグインを ImageJ にインストールします。 ImageJ ソフトウェアを開き、DSM アルゴリズム内で次の入力パラメータを設定します。輪郭閾値 (Ct) = 253.020、タイプ= 赤、中心スケール (S) = 0.8、低 (Lt)/High (Ht) 定量限界= 0/62。 セクション6.8 から保存された画像を ImageJ で開きます。プラグインタブからDSM スキャンボタンを選択し、開いた画像に応じて列と行の数を定義します。プログラムは、検出領域を認識し、自動的に領域に従ってナノ粒子の散乱強度を解析することができます。DSM スキャンウィンドウ内で次の入力パラメータを設定します。サイズ変更の割合= 25、スポットの直径 (ピクセル単位) = 190 –200、直径の範囲= 32、増分の直径 (ピクセル) = 8、 DSM の構成-低limit = 0、上限= 62、隣接距離= 100、バイアス = 0 の減算。注: ナノ粒子の散乱強度の結果は、スライド上の結合したエキソソームの量を反映しています。