باستخدام نانوبلازمون-تعزيز تشتت والتصوير المجهر منخفضه التكبير لقياس الأورام المشتقة من الورم
Summary
ويعوق الترجمة السريرية للخلايا الحيوية المشتقة من الخلايا الاحيائيه المصابة والخبيثة الافتقار إلى طرق التحديد الكمي السريعة والدقيقة. يصف هذا التقرير استخدام صور المجهر منخفضه التكبير في الحقل المظلم لقياس أنواع فرعيه معينه من النوع exosome في المصل الصغير الحجم أو عينات البلازما.
Abstract
الخلايا المصابة أو الخبيثة في كثير من الأحيان تفرز المزيد من الجذور ، مما يؤدي إلى مستويات مرتفعه من الأورام المصاحبة للمرض في الدورة الدموية. هذه التماثيل لديها القدرة علي ان تكون بمثابه المؤشرات الحيوية لتشخيص الامراض ورصد تطور المرض واستجابه العلاج. ومع ذلك ، فان معظم إجراءات تحليل exosome تتطلب العزلة exosome وتنقيه الخطوات ، والتي عاده ما تستغرق وقتا طويلا وكثيفه العمالة ، التالي من فائده محدوده في الإعدادات السريرية. يصف هذا التقرير الاجراء السريع لتحليل المؤشرات الحيوية المحددة علي الغشاء الخارجي لل exosomes دون الحاجة إلى عزل منفصلة وخطوات تنقيه. في هذه الطريقة ، يتم القبض علي التماثيل علي سطح الشريحة من قبل الأجسام المضادة الخاصة exosomes ومن ثم التهجين مع مجسات الأجسام المضادة جسيمات متناهي-مترافق محدده لمرض. بعد التهجين ، يتم تحديد وفره من السكان exosome الهدف عن طريق تحليل منخفضه التكبير المجهر الحقل المظلم (LMDFM) الصور من جسيمات نانويه منضم. ويمكن اعتماد هذا النهج بسهوله للبحوث والاستخدام السريري لتحليل الاغشيه المرتبطة بالغشاء الحيوي exosome مرتبطة بالمرض.
Introduction
يتم الإفراج عن التماثيل من معظم أنواع الخلايا وتلعب دورا رئيسيا في الاتصالات من الخلية إلى الخلية ، بما في ذلك العمليات الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة بالامراض المختلفة ، لأنها يمكن ان تكون موطنا لأنسجه محدده أو أنواع الخلايا ، وتحتوي علي مجموعه متنوعة من الأحماض النووية ، والبروتينات ، والدهون التي تعكس الخلية الاصليه ويمكن ان تمارس اثارا تنظيميه علي الخلايا المتلقية لها1،2،3،4. غالبا ما تفرز التماثيل في مستويات مرتفعه في الدول المرض ، ويمكن ان تتفاعل مع كل من الخلايا المتجاورة والبعيدة ، ووجدت في تركيز عال نسبيا في الدورة الدموية ، فضلا عن معظم سوائل الجسم الأخرى ، بما في ذلك اللعاب والبول والبنكرياس والصفراء عصير ، وغسل القصبات السائل5، 6،7،8،9،10،11. هذا وفره واستقرار التماثيل في سوائل الجسم البشري ، إلى جانب طبيعتها الغنية بالمعلومات ، يجعلها العلامات الحيوية المثالية لتشخيص الامراض ورصد العلاج.
وهذا يشمل الأورام المشتقة من الورم (TDEs) ، والتي تحتوي علي عوامل الورم محدده أو انتقائية ، والتي يمكن ان تكون بمثابه المؤشرات الحيوية المرض ، بما في ذلك الأورام المرتبطة الورم المصاحبة. TDEs يمكن ان تشارك في أعاده عرض البيئة المجهرية الورم لتسهيل نمو الورم والانبثاث ، وتنظيم الاستجابات المضادة للورم12. زيادة إفراز TDE هو النمط الظاهري الشائع لمعظم أنواع السرطان والعديد من الميزات من البيئة المجهرية الورم ، بما في ذلك نقص الأكسجين ، والحموضة الحمضية ، والتهاب ، ومن المعروف ان تعزيز إفراز exosome. ومن المستغرب ، نظرا لعدد من الخلايا التي تفرز الجذور ، وزيادة في المستوي الإجمالي exosomes يمكن ، في حد ذاته ، تعمل بوصفها العلامات البيولوجية السرطان. علي سبيل المثال ، وجدت دراسة حديثه ان تركيز EV الكلي في عصير الصفراء يميز الخبيثة وغير الخبيثة في المرضي تضيق القناة الصفراوية المشتركة مع 100 ٪ دقه7. وقد تم العثور علي نتائج مماثله مع الدراسات باستخدام سوائل الجسم الأخرى, بما في ذلك البلازما. ومع ذلك ، نظرا لاحتمال الخضوع لاختلاف الموضوع ، وغيرها من العوامل المربكة ، ركزت معظم الدراسات التحقيق في التماثيل البيولوجية كمرض المؤشرات الحيوية علي الكشف عن المؤشرات الحيوية التي ترتبط بشكل انتقائي مع TDEs بدلا من مجموع exosomes ارقام.
ترجمه المؤشرات الحيوية exosome في الممارسة السريرية ، ومع ذلك ، لا يزال تحديا لان معظم التقارير التي أبلغت عنها النهج المقايسة تتطلب وقتا طويلا وإجراءات العزل كثيفه العمالة 13. وتشمل أساليب العزل exosome شعبيه حاليا ultracentrifugation حلول ، والتدرجات الكثافة ، وحجم الاستبعاد ، والامطار المشتركة ، والتقاط التقارب ، ونهج العزلة ميكروفلويديك. Ultracentrifugation حلول هو “المعيار الذهبي” الأسلوب ، والأكثر شيوعا لعزل exosome ، ولكن هذا الاجراء يستغرق وقتا طويلا والنتائج في الضرر exosome والتكتلات غشاء exosome ، وتنتج عينات exosome التي هي ملوثه مع البروتينات والبروتينات الدهنية وغيرها من العوامل التي يمكن ان تؤثر علي التحليلات اللاحقة14. معظم أساليب العزلة exosome ، بما في ذلك التسميد ، لا يمكن فصل التماثيل (30-150 نانومتر) من الحويصلات الصغرى (100-1000 نانومتر) والهيئات ابوتوتيك (100-5000 نانومتر) ، التي تنشا من خلال أليات مختلفه ولها وظائف مختلفه ، نظرا لحجم التداخل بين هذه المجموعات ، وتنوع السكان exosome15. هناك حاجه إلى نهج جديده لتحسين حساسية واستنساخ من اختبارات exosome عن طريق تحسين الانتعاش exosome مع الحد من الضرر exosome والتلوث ، علي الرغم من ان اي اختبارات علي أساس مثل هذه الأساليب سوف تحتاج أيضا إلى ان تكون الأمثل لجعلها مناسبه للترجمة إلى التطبيقات في الإعدادات السريرية.
وقد اقترحت العديد من الدراسات الحديثة لاستخدام منصات متكاملة للتقاط وتحليل التماثيل مباشره من سوائل الجسم. تستخدم هذه الطرق ميكروفلويدريك ، كهربية ، التقاط تقارب ، وطرق أخرى مختلفه للعزل exosome ، والكيمياء الكهربائية ، والرنين البلازمون سطحي السطحية ، وغيرها من الطرق للكشف عن التماثيل الملتقطة. وليس من الواضح مدي جدوى العديد من هذه النهج في البيئات السريرية ، بسبب تعقيدها ، والنفقات ، وانخفاض الانتاجيه أو غيرها من القضايا.
وقد وضعنا الفحص السريع وغير مكلفه التي يمكن استخدامها للقياس الكمي الحساسة والمحددة من التماثيل الاجماليه والأنواع الفرعية المحددة exosomes ، بما في ذلك الامراض المرتبطة بالمبيدات ، مثل TDEs ، والذي يتطلب سوي كميه صغيره من عينه والتي توظف سير عمل مبسطه مناسبه للبيئات السريرية. في هذا الفحص ، يتم تغليف شريحة مع الأجسام المضادة التي تربط اما علامة exosome محدده أو محدده المرض التي أعرب عنها علي سطح exosome من أجل التقاط مباشره التماثيل المستهدفة الموجودة في البلازما حجم صغير أو عينات المصل تطبيقها علي الآبار علي الشريحه. ثم يتم تهجين الجسيمات متناهي الملتقطة مع الأجسام المضادة المترافقة التي تعترف بالعلامات الحيوية للفائدة علي هذه المبيدات الحشرية ، والتي يمكن ان تكون اما مؤشر exosomes عام أو عامل محدد لنوع فرعي exosomes الفائدة. ثم يتم التقاط صور هذه الآبار النموذجية باستخدام مجهر الحقل المظلم (بورصة دبي) وتحليلها لقياس الضوء المتناثر من الجسيمات النانويه المرتبطة بالفوائد الملتقطة في كل عينه جيدا6،16،17. وعلي وجه الخصوص ، فان تصوير عينه كامله بشكل جيد من خلال التكبير المنخفض في سوق دبي السينمائي (LMDFM) يتجنب تحيز الاختيار الذي تم مواجهته بتحليلات عاليه التكبير في سوق دبي السينمائي عندما يجب علي المستخدمين اختيار الحقول التي سيتم التقاطها لتحليل الصور اللاحقة مباشره. تحليل الصور LMDFM يخضع لتشتت الضوء التحف من المخالفات السطحية ، بما في ذلك الخدوش والحطام عينه ، ولكن هذه الخلفية يمكن ان تخفض باستخدام خوارزميه الحد من الضوضاء بسيطه وضعنا لتشغيل علي برنامج تحليل صوره المعاهد القومية للصحة ، ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). تطبق هذه الخوارزميه أولا عتبه كفاف الإدخال التي يتم استخدامها للكشف عن حدود العينة جيدا لتعريف منطقه الصورة للتحليل اللاحق. ثم يتم تقسيم المنطقة المحددة من قبل هذه المنطقة كفاف إلى اشاره منفصلة موجودة في القناات الحمراء والزرقاء والخضراء من الصورة ويتم طرح القناة الزرقاء من القناة الحمراء لأزاله الاشاره الناشئة عن التحف السطحية والاضاءه متفاوتة من nanorod اشاره.
توضح هذه المقالة كيفيه استخدام هذا الفحص للتحديد الكمي لمستويات exosome الاجماليه أو المحددة بسرعة في عينات البلازما أو المصل.
Protocol
Representative Results
Discussion
التماثيل تنشا من اينفاجينيشنز المنظمة من الغشاء الباطني الخارجي الذي ينتج الهيئات متعددة الحويصلات ، مجموعه فرعيه متخصصة من التنظير الباطني التي تحتوي علي عدد كبير من الحويصلات داخل الجسم التي تخضع للاندماج مع غشاء البلازما للإفراج ناضجه التماثيل في الفضاء خارج الخلية. بسبب هذا المسار التكوين الحيوي ، يمكن ان تحمل التماثيل عوامل الغشاء المرتبطة الكسور الغشاء التي تتكون أو الصمامات مع غشاء التنظير الباطني ، فضلا عن أنواع مختلفه من مكونات عصاري خلوي متعددة ، التالي تحتوي علي شحنات من البروتينات والحمض النووي والأنواع الفرعية المختلفة RNA (mRNAs ، ميكرورناس ، طويلة غير الترميز RNAs) التي يمكن ان تعكس النمط الظاهري للخلية من أصل20. منذ يتم إفراز التماثيل من قبل معظم ان لم يكن جميع أنواع الخلايا ، ويمكن ان يحمل زيادة إفراز من الخلايا المريضة أو الخبيثة ، وتتراكم في معظم سوائل الجسم ، والتماثيل هي موضوع التحقيق الشامل والمنهجي باعتبارها الحد الأدنى الواعدة وسائل الغازية للكشف عن حالات امراض محدده ورصد استجاباتها للعلاج21.
العزلة exosome ، وهو مطلوب لمعظم التحليلات exosome الحالية ، هو اجراء طويلة وكثيفه العمالة ، وتقييد الترجمة السريرية من المؤشرات الحيوية المرتبطة exosome مع الاهميه الطبية المحتملة. الخصائص الفيزيائية أو قد تضر النزاهة exosome15. النهج الجديدة قيد التطوير التي قد تسمح بتحليلات exosome أسرع ، ولكن ليس من الواضح كيف يمكن ان يكون من الممكن تنفيذ العديد من هذه المنصات في الإعدادات السريرية المستحقة.
في هذا التقرير ، نقدم نهجا جديدا يسمح بالقياس الكمي لجسيمات متناهي عالي الانتاجيه باستخدام التكبير المنخفض للصور المجهر الميداني الداكن. هذا الأسلوب لا يتطلب تنقيه exosome ، معدات مخصصه مكلفه ، أو الخبرة الفنية الجديدة ، وينبغي بالتالي ان تكون قابله للترجمة السريعة في معظم البحوث والإعدادات السريرية. ويمكن تطبيق الفحص لدينا علي وجه التحديد كميه تركيز السكان exosome المستهدفة التي تحمل الحيوية محدده عندما يتم مقارنه نتائج الفحص إلى منحني قياسي ، لان لدينا نتائج معرض هناك ارتباط خطي قوي (R2 = 0.99) بين الاستجابة البصرية وتركيز exosome. ولإظهار الإمكانات الحقيقية لهذا النهج ، قدمنا بيانات استخدمنا فيها هذه الطريقة لقياس تركيز المؤشرات البيولوجية المصاحبة لسرطان البنكرياس في عينات المصل التي تم الحصول عليها من المرضي الذين يعانون من وبدون سرطان البنكرياس.
في LMDFM ، يتم تحديد العينة بأكملها بشكل جيد لتجنب تحيز الاختيار الموجود في تحليلات بورصة دبي عاليه التكبير ، حيث يجب علي المستخدمين اختيار الحقول العينة مباشره للتقاط لتحليل الصورة اللاحقة ، ولكن يخضع لتشتت الضوء التحف من سطح مخالفات ، بما في ذلك الخدوش والحطام عينه. ويمكن تقليل هذه الخلفية للكشف عن الهدف المستمدة exosome الاشاره باستخدام لدينا DSM خفض الضوضاء خوارزميه التي تعمل علي برنامج تحليل الصور المعاهد القومية للصحة, ImageJ, ولكن يجب الحرص لا يزال يتعين اتخاذها لتجنب إدخال مثل هذه التحف التي قد تقلل من المدى الديناميكي الفحص.
المواد المستخدمة في هذا الفحص:
وقد تم شراء الشرائح المتعددة البروتينات A/G التي تحمل 1 μL/well من شركه Arrayit (AGMSM192BC). تم الحصول علي جسيمات نانويه من نانوبارتز (C12-25 -650-TN-DIH-50-1 ، 6.4 x 1012/مل). تم التقاط صور سوق دبي السينمائي مع كاميرا نيكون DiR2 الرقمية الملحقة بمجهر تي-اكليبس من نيكون ، مع أضاءه متناسقة ووقت التعرض ل1/220 s. تم شراء خط الخلية PANC-1 المستخدم في هذه الدراسة من مجموعه الثقافة الامريكيه النوع.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم العمل في المقام الأول من خلال تمويل البحوث التي تقدمها المعاهد القومية للصحة (U01CA214254 ، R01HD090927 ، R01AI122932 ، R01AI113725 و R21Al126361) ، وجائزه المحقق الشاب في ولاية اريزونا (ABRC).
Materials
| Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
| Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
| Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
| NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
| Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
| Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
| TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |
References
- Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes. Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Liang, K., et al. Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
- Severino, V., et al. Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses. Gastroenterology. 153 (2), 495-504 (2017).
- Osteikoetxea, X., et al. Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).
- Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer. Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).
- Kim, J. E., et al. Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study. Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).
- Boussadia, Z., et al. Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).
- An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum. Journal of Proteome Research. , (2018).
- Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies. Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Sun, D., et al. Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images. Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).
- Sun, D., Hu, T. Y. A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies. Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).
- Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer. Cell Death & Disease. 8 (10), e3134 (2017).
- Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes. Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. Exosomes: a cancer theranostics road map. Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).
