Verwendung von Nanoplasmon-Enhanced Scattering und Low-Magnification Microscope Imaging zur Quantifizierung von Tumor-Derivate-Exosomen
Summary
Die klinische Übersetzung von exosominierten Biomarkern für kranke und bösartige Zellen wird durch das Fehlen schneller und präziser Quantifizierungsmethoden behindert. Dieser Bericht beschreibt den Einsatz von Mikroskop-Bildern mit geringer Vergrößerung im Dunkelfeld, um bestimmte exotische Subtypen in kleinen Volume-Serum-oder Plasmaproben zu quantifizieren.
Abstract
Infizierte oder bösartige Zellen scheiden häufig weitere Exosome aus, was zu einem erhöhten Gehalt an krankheitsbedingten Exosomen im Kreislauf führt. Diese Exosomen haben das Potenzial, als Biomarker für die Krankheitsdiagnose zu dienen und den Verlauf und die Behandlung von Krankheiten zu überwachen. Die meisten exotischen Analyseverfahren erfordern jedoch exotische Isolations-und Reinigungsschritte, die in der Regel zeit-und arbeitsintensiv sind und daher in klinischen Umgebungen von begrenztem Nutzen sind. Dieser Bericht beschreibt ein schnelles Verfahren zur Analyse bestimmter Biomarker an der äußeren Membran von Exosomen, ohne dass separate Isolations-und Reinigungsschritte erforderlich sind. Bei dieser Methode werden Exosomen auf der Oberfläche eines Dias von exosomspezifischen Antikörpern erfasst und dann mit nanopartikulierten Antikörper-Sonden, die für eine Krankheit spezifisch sind, hybridiert. Nach der Hybridisierung wird die Fülle der zielexotischen Population durch die Analyse von Bildern des gebundenen Nanopartikels mit geringer Vergrößerung des Dunkelfeldes (LMDFM) bestimmt. Dieser Ansatz lässt sich für die Forschung und den klinischen Einsatz leicht anwenden, um membranassoziierte Exosomenbiomarker im Zusammenhang mit Krankheiten zu analysieren.
Introduction
Exosome werden von den meisten Zelltypen freigesetzt und spielen eine Schlüsselrolle in der Zellkommunikation, einschließlich pathophysiologischer Prozesse, die mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, da sie für bestimmte Gewebe oder Zelltypen beheimatet sein können und eine Vielzahl von Nukleinsäuren enthalten. Proteine und Lipide, die ihre Ursprungszelle reflektieren und regulatorische Auswirkungen auf ihre Empfängerzellen 1,2,3,4 ausüben können. Exosome werden oft in höheren Lagen in Krankheitszuständen ausgeschieden, können sowohl mit benachbarten als auch mit entfernten Zellen interagieren und werden bei relativ hoher Konzentration im Kreislauf sowie bei den meisten anderen Körperflüssigkeiten, einschließlich Speichel, Urin, Bauchspeicheldrüse und Galle gefunden. Saft und Bronchoalveolare Lavageflüssigkeit5,6, 7, 8, 9,10, 11. Diese Fülle und Stabilität von Exosomen in menschlichen Körperflüssigkeiten, gepaart mit ihrer informationsreichen Natur, macht sie zu idealen Biomarkern für die Krankheitsdiagnose und Behandlungsüberwachung.
Dazu gehören tumorabgeleitete Exosomen (TDEs), die tumorspezifische oder selektive Faktoren enthalten, die als Krankheitserreger dienen können, darunter tumorassoziierte Mutantenallele. TDEs können an der Umgestaltung der Tumormikroumgebung teilnehmen, um die Tumorentwicklung und Metastasen zu erleichtern, und die Anti-Tumor-Reaktionen zu regulieren 12. Die erhöhte TDE-Sekretion ist ein häufiges Phenotyp der meisten Krebserkrankungen und mehrere Merkmale der Tumor-Mikroumgebung, einschließlich Hypoxie, saurer pH-Wert und Entzündungen, sind dafür bekannt, exosome secretion zu fördern. Überraschenderweise kann sich angesichts der Anzahl der Zellen, die Exosome abscheiden, ein Anstieg des Gesamt-Exosomensäveaus als Biomarker für Krebs selbst fungieren. So hat eine aktuelle Studie herausgefunden, dass die gesamte EV-Konzentration im Gallensaft bösartig und nicht bösartig bei den gängigen Gallengang Stenose-Patienten mit 100% Genauigkeitunterscheidet. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Studien mit anderen Körperflüssigkeiten, darunter Plasma, gefunden. Aufgrund des Potenzials für Subjektvarianten und anderer verwirrender Faktoren haben sich die meisten Studien, die Exosome als Biomarker von Krankheiten untersuchen, auf die Erkennung von Biomarkern konzentriert, die selektiv mit TDEs in Verbindung gebracht werden, anstatt mit totalen Exosomenfaktoren. Zahlen.
Die Umsetzung exotischer Biomarker in die klinische Praxis ist jedoch nach wie vor eine Herausforderung, da die meisten berichteten exotischen Assay-Ansätze zeitaufwändige und arbeitsintensive Isolationsverfahren 13 erfordern. Zur Zeit sind die populären exotischen Isolationsmethoden Ultrazentrifugation, Dichtegradienten, Größenausschluss, Co-Niederschlag, Affinitätsaufnahme und mikrofluidische Isolationsansätze. Ultrazentrifugation ist die “Goldstandard”-Methode, und wird am häufigsten für exotische Isolationen verwendet, aber diese Prozedur ist zeitaufwendig und führt zu exotischen Schäden und exotischen Membranhäuschen, und produziert exotische Proben, die mit Proteine, Lipoproteine und andere Faktoren, die die nachfolgenden Analysen beeinflussen können14. Die meisten exotischen Methoden, einschließlich der Ultrakentrifugation, können die Exosomen (30 – 150 nm) nicht von Mikrovesikeln (100 – 1000 nm) und apoptotischen Körpern (100 – 5000 nm) trennen, die durch unterschiedliche Mechanismen entstehen und aufgrund der Größe unterschiedliche Funktionen haben. Überschneidungen zwischen diesen Gruppen,und die Vielfalt der exotischen Populationen 15. Neue Ansätze sind notwendig, um die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit exotischer Assays zu verbessern, indem die exosomische Erholung verbessert wird und gleichzeitig exosomische Schäden und Verunreinigungen verringert werden, obwohl alle auf solchen Methoden basierenden Assays ebenfalls optimiert werden müssen, um sie zu erhalten. Für die Übersetzung in Anwendungen in klinischen Umgebungen geeignet.
Mehrere aktuelle Studien haben vorgeschlagen, integrierte Plattformen zu nutzen, um Exosomen direkt aus Körperflüssigkeiten zu erfassen und zu analysieren. Diese Methoden verwenden mikrofluidische, elektrokinetische, Affinitätsaufnahme und verschiedene andere Methoden zur Exosomenisolierung und Elektrochemie, Oberflächenplasmonresonanz und andere Methoden, um gefangene Exosome zu erkennen. Es ist nicht klar, wie machbar viele dieser Ansätze in klinischen Umgebungen sein werden, aufgrund ihrer Komplexität, Kosten, Tiefststände oder anderer Probleme.
Wir haben einen schnellen und kostengünstigen Test entwickelt, der für die sensible und spezifische Quantifizierung von Gesamtexosomen und spezifischen exotischen Subtypen, einschließlich krankheitsbedingter Exosomen, wie TDEs, verwendet werden kann, die nur eine geringe Anzahl von Proben erfordern und die Mit einem schlanken Workflow, der für klinische Umgebungen geeignet ist. In diesem Test wird eine Folie mit Antikörpern beschichtet, die entweder einen exosomartigen oder krankheitsspezifischen Marker binden, der auf der exotischen Oberfläche ausgedrückt wird, um Zielexosomen, die in kleinen Plasma-oder Serumproben enthalten sind, die auf Brunnen auf dem schlittern. Gefangene Exosome werden dann mit einem antikörperkonjugierten Nanopartikel hybridiert, der den Biomarker erkennt, der auf diesen Exosomen von Interesse ist, der entweder ein allgemeiner exotischer Marker oder ein spezifischer Faktor für eine exotische Unterart von Interesse sein kann. Die Bilder dieser Probenbrunnen werden dann mit Hilfe eines Dunkelfeldmikroskops (DFM) erfasst und analysiert, um das Licht zu messen, das von Nanopartikeln verstreut wird, die an Exosomen von Interesse gebunden sind, die in jeder Probeerfasstwerden, gut 6,16,17. Insbesondere verhindert die Abbildung einer ganzen Probe durch die Low-Vergrößerung DFM (LMDFM) eine Selektionsneigung, die bei DFM-Analysen mit hoher Vergrößerung auftritt, wenn der Anwender direkt wählen muss, welche Felder für die anschließende Bildanalyse erfasst werden sollen. Die LMDFM-Bildanalyse unterliegt leichten Streuungsartefakten aus Oberflächenunregelmäßigkeiten, einschließlich Kratzern und Probenschutt, aber dieser Hintergrund kann mit einem einfachen Geräuschminderungsalgorithmus reduziert werden, den wir entwickelt haben, um auf dem NIH-Bildanalyseprogramm zu arbeiten, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Dieser Algorithmus wendet zunächst eine Eingangskonturschwelle an, mit der die Grenzen des Musters gut erkannt werden, um den Bereich des Bildes für die spätere Analyse zu definieren. Die Region, die durch diese Konturregion definiert wird, wird dann aufgeteilt, um das Signal zu trennen, das in den roten, blauen und grünen Kanälen des Bildes vorhanden ist, und der blaue Kanal wird vom roten Kanal abgezogen, um das Signal zu entfernen, das aus Oberflächenartefakten und ungleichmäßiger Beleuchtung aus Nanorod entsteht. signal.
Dieser Artikel beschreibt, wie man diesen Test benutzt, um in Plasma-oder Serumproben schnell entweder vollständige oder spezifische Exosomen-Levels zu quantifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Exosomen entstehen durch regulierte invaginisierender invaginierender der äußeren endosomischen Membran, die multivesiculäre Körper produzieren, eine spezialisierte Untergruppe von Endosomen, die eine große Anzahl von intraluminalen Bläschen enthalten, die sich mit der Plasmamembran vereinigen, um reifen zu lassen. Exkodem in den extrazellulären Raum. Aufgrund dieses Biogenese-Weges können Exosome membrangebundene Faktoren tragen, die mit Membranfraktionen in Verbindung gebracht werden, die mit der endosomischen Membran bestehen oder verschmelzen, sowie mehrere verschiedene Arten von zytosoolischen Komponenten, und somit Ladungen von Proteinen enthalten, DNA Und verschiedene RNA-Subtypen (mRNAs, microRNAs, lange nicht-kodierende RNAs), die den Phenotyp ihrer Ursprungszelle 20 reflektieren können. Da Exosomen von den meisten, wenn nicht sogar von allen Zelltypen ausgeschieden werden, eine erhöhte Sekretion von kranken oder bösartigen Zellen aufweisen und sich in den meisten Körperflüssigkeiten ansammeln, sind Exosomen Gegenstand umfassender und systematischer Untersuchungen als vielversprechende minimale invasive Mittel, um bestimmte Krankheitszustände zu erkennen und ihre Reaktionen auf die Behandlung21zu überwachen.
Exosomische Isolierung, die für die meisten aktuellen exotischen Analysen erforderlich ist, ist ein langwieriges und arbeitsintensives Verfahren, das die klinische Übersetzung von exosomassoziierten Biomarkern mit potenzieller medizinischer Relevanz einschränkt. Viele gängige Isolationsmethoden (Ultrazentrifugation, Größenausschluss, Niederschlag, etc.) unterscheiden Exosomen (30 – 100 nm) oft nicht ausreichend von Mikro-Vesikeln (100 – 1000 nm) und apoptotischen Körpern (100 – 5000 nm) aufgrund von Überlappungen in ihren Größenbereichen oder Leibestialt oder kann die exotische Integrität15beschädigen. Es sind neue Ansätze in der Entwicklung, die eine schnellere Exosomenanalyse ermöglichen könnten, aber es ist nicht klar, wie machbar es sein könnte, viele dieser Plattformen in klinischen Umgebungen durchzuführen.
In diesem Bericht stellen wir einen neuartigen Ansatz vor, der eine Nanopartikel-basierte Exozialquantifizierung mit Hilfe von Bildern mit geringer Vergrößerung des Dunkelfeldes ermöglicht. Diese Methode erfordert keine Exosomenreinigung, teure Spezialgeräte oder neuartiges technisches Know-how und sollte daher in den meisten forschenden und klinischen Umgebungen schnell übersetzt werden können. Unser Test kann angewendet werden, um die Konzentration einer zielexotischen Population mit einem bestimmten Biomarker genau zu quantifizieren, wenn die Untersuchungsergebnisse mit einer Standardkurve verglichen werden, da unsere Ergebnisse zeigen, dass es eine starke lineare Korrelation gibt (R2 = 0,99). Zwischen optischer Reaktion und exotischer Konzentration. Um das reale Potenzial dieses Ansatzes zu demonstrieren, haben wir Daten zur Verfügung gestellt, auf denen wir mit dieser Methode die Konzentration eines exotischen Biomarkers im Zusammenhang mit Bauchspeicheldrüsenkrebs in Serumproben quantifizieren, die von Patienten mit und ohne gewonnen wurden. Bauchspeicheldrüsenkrebs.
In LMDFM wird der gesamte Musterbrunnen abgebildet, um die Selektionsneigung zu vermeiden, die in hochvergrößernden DFM-Analysen zu finden ist, bei denen der Anwender die Musterfelder direkt auswählen muss, um sie für die anschließende Bildanalyse zu erfassen, aber von der Oberfläche aus leichten Streuungsartefakten unterworfen ist. Unregelmäßigkeiten, darunter Kratzer und Probenschrott. Dieser Hintergrund kann reduziert werden, um zielgerichtete exosom-abgeleitete Signale zu erkennen, indem wir unseren DSM-Geräuschminderungsalgorithmus verwenden, der auf dem NIH-Bildanalyseprogramm ImageJ läuft, aber es muss immer noch darauf geachtet werden, dass solche Artefakte nicht eingeführt werden, die den dynamischen Bereich der Die Ansagen.
Materialien, die in diesem Test verwendet werden:
Die SuperProtein A/G-Dias mit 1 μL/gut wurden von der Arrayit Corporation (AGMSM192BC) gekauft. Nanopartikel wurden von Nanopartz (C12-25-650-TN-DIH-50-1, 6.4 x 1012/mL) gewonnen. Die DFM-Bilder wurden mit einer Nikon DiR2 Digitalkamera aufgenommen, die an einem Nikon-Ti-Eclipse-Mikroskop befestigt ist, mit konsistenter Beleuchtung und einer Ein-14-Sichtungszeit. Die in dieser Studie verwendete Zelllinie PANC-1 wurde von der American Type Culture Collection erworben.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurde die Arbeit in erster Linie durch Forschungsmittel des NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 und R21Al126361-01), der Arizona Biomedical Research Commission (ABRC), der Nachwuchsforschungshinweise der Arizona Biomedical Research Commission (ABRC).
Materials
| Eppendorf Repeater stream | Fisher Scientific | 05-401-040 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3120000011 | 0.1 – 2.5 µL, dark gray |
| Functionalized Gold Nanorods | Nanopartz | C12-25-650-TN-DIH-50-1 | In vitro neutravidin polymer functionalization |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | |
| Incu-shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | |
| Inverted Research Microscope | Nikon | Ti-DH | With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage |
| NIS-Elements | Nikon | Microscope imaging software | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | GE Healthcare Life Sciences | SH30256.02 | HyClone |
| Protein A/G Treated Glass Substrate Slides | Arrayit Corp. | AGMSM192BC | Premium microarray substrate |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Q500-110 | With standard probe (#4220) |
| Superblock blocking buffer | Thermo Scientific | ||
| TWEEN 20 | Sigma Life Sciences | 9005-64-5 |
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