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Bioengineering

Utilisation de la diffusion améliorée par Nanoplasmon et imagerie microscopique à faible grossissement pour quantifier les exosomes dérivés de tumeurs

Published: May 24, 2019
doi:
10.3791/59177
, , , ,
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,West China Hospital of Sichuan University, 2Virginia G. Piper Biodesign Center for Personalized Diagnostics, The Biodesign Institute,Arizona State University, 3School of Biological and Health Systems Engineering,Arizona State University, 4Department of Electrical and Computer Engineering,North Dakota State University

Summary

La traduction clinique de biomarqueurs dérivés d’exosome pour les cellules malades et malignes est entravée par l’absence de méthodes de quantification rapides et précises. Ce rapport décrit l’utilisation d’images de microscope à champ sombre à faible grossissement pour quantifier des sous-types spécifiques d’exosome dans des échantillons de sérum ou de plasma à petit volume.

Abstract

Les cellules infectées ou malignes sécrètent fréquemment plus d’exosomes, conduisant à des niveaux élevés d’exosomes associés à la maladie dans la circulation. Ces exosomes ont le potentiel de servir de biomarqueurs pour le diagnostic de la maladie et de surveiller la progression de la maladie et la réponse au traitement. Cependant, la plupart des procédures d’analyse exosome exigent des étapes d’isolement et de purification d’exosome, qui sont généralement chronophages et laborieuses, et donc d’utilité limitée dans les milieux cliniques. Ce rapport décrit une procédure rapide pour analyser des biomarqueurs spécifiques sur la membrane externe des exosomes sans nécessiter d’isolement séparé et des étapes de purification. Dans cette méthode, les exosomes sont capturés sur la surface d’une diapositive par des anticorps spécifiques à l’exosome, puis hybridés avec des sondes d’anticorps conjuguées aux nanoparticles spécifiques à une maladie. Après l’hybridation, l’abondance de la population exosome cible est déterminée par l’analyse des images du microscope à champ foncé à faible grossissement (LMDFM) des nanoparticules liées. Cette approche peut être facilement adoptée pour la recherche et l’utilisation clinique pour analyser les biomarqueurs exosome associés à la membrane liés à la maladie.

Introduction

Les exosomes sont libérés de la plupart des types cellulaires et jouent un rôle clé dans les communications entre cellules, y compris les processus pathophysiologiques associés à diverses maladies, car ils peuvent être à la maison à des tissus spécifiques ou des types de cellules, et contiennent une variété d’acides nucléiques , les protéines et les lipides qui reflètent leur cellule d’origine et peuvent exercer des effets réglementaires sur leurs cellules réceptrices1,2,3,4. Les exosomes sont souvent sécrétés à des niveaux élevés dans les États de la maladie, peuvent interagir avec les cellules adjacentes et éloignées, et se trouvent à une concentration relativement élevée dans la circulation ainsi que la plupart des autres fluides corporels, y compris la salive, l’urine, pancréatique et la bile jus, et le liquide de lavage bronchoalvéolaire5,6,7,8,9,10,11. Cette abondance et la stabilité des exosomes dans les fluides corporels humains, couplés à leur nature riche en informations, en font des biomarqueurs idéaux pour le diagnostic de la maladie et la surveillance du traitement.

Cela inclut les exosomes dérivés de tumeurs (TDEs), qui contiennent des facteurs spécifiques à la tumeur ou sélectifs, qui peuvent servir de biomarqueurs de la maladie, y compris les allèles mutants associés aux tumeurs. Les TDEs peuvent participer à la retouche du microenvironnement tumoral pour faciliter le développement des tumeurs et les métastases, et réguler les réponses anti-tumorales12. La sécrétion accrue de TDE est un phénotype commun de la plupart des cancers et plusieurs caractéristiques du microenvironnement tumoral, y compris l’hypoxie, le pH acide et l’inflammation, sont connues pour favoriser la sécrétion d’exosome. Étonnamment, étant donné le nombre de cellules qui sécrètent des exosomes, une augmentation du niveau total d’exosome peut, elle-même, fonctionner comme un biomarqueur du cancer. Par exemple, une étude récente a révélé que la concentration totale de EV dans le jus de bile discrimine malignes et non malignes chez les patients atteints de sténose du canal biliaire commun avec 100% de précision7. Des résultats similaires ont été trouvés avec des études utilisant d’autres fluides corporels, y compris le plasma. Cependant, en raison de la possibilité de variations de sujets et d’autres facteurs confusionnels, la plupart des études sur les exosomes comme biomarqueurs de la maladie se sont concentrées sur la détection de biomarqueur qui sont sélectivement associés aux TDEs au lieu de l’exosome total Numéros.

Cependant, traduire les biomarqueurs exosome en pratique clinique demeure difficile, car la plupart des approches d’essais exosome signalées exigent des procédures d’isolement chronophages et intensives en main-d’œuvre 13. Les méthodes d’isolement d’exosome couramment utilisées incluent l’ultracentrifugation, les gradients de densité, la taille-exclusion, la co-précipitation, la capture d’affinité et les approches d’isolement microfluidique. Ultracentrifugation est la méthode “Gold standard”, et est le plus couramment utilisé pour les isolations exosome, mais cette procédure est chronophage et entraîne des dommages exosome et exosome membrane clustering, et produit des échantillons d’exosome qui sont contaminés par protéines, lipoprotéines et autres facteurs pouvant influencer les analyses ultérieures14. La plupart des méthodes d’isolement exosome, y compris l’ultracentrifugation, ne peuvent séparer les exosomes (30 – 150 nm) des micro-vésicules (100 – 1000 nm) et des corps apoptotiques (100 – 5000 nm), qui surviennent par différents mécanismes et ont des fonctions différentes, en raison de la taille chevauchement entre ces groupes, et la diversité des populations exosome15. De nouvelles approches sont nécessaires pour améliorer la sensibilité et la reproductibilité des essais d’exosome en améliorant la récupération des exosome tout en réduisant les dommages et la contamination des exosome, bien que tout dosage basé sur ces méthodes devra également être optimisé pour les rendre adapté à la traduction vers des applications en milieu clinique.

Plusieurs études récentes ont proposé d’utiliser des plateformes intégrées pour capturer et analyser des exosomes directement à partir de fluides corporels. Ces méthodes emploient la microfluidique, l’électrocinétique, la capture d’affinité, et diverses autres méthodes pour l’isolement d’exosome, et l’électrochimie, la résonance de Plasmon de surface, et d’autres méthodes pour détecter les exosomes capturés. On ne sait pas très bien dans quelle mesure ces approches seront réalisables dans des contextes cliniques, en raison de leur complexité, de leurs dépenses, de leur faible débit ou d’autres problèmes.

Nous avons développé un dosage rapide et peu coûteux qui peut être utilisé pour la quantification sensible et spécifique des exosomes totaux et des sous-types spécifiques de l’exosome, y compris les exosomes associés à la maladie, tels que les TDEs, qui ne nécessitent qu’une petite quantité d’échantillon et qui utilise un workflow rationalisé adapté aux environnements cliniques. Dans ce dosage, une diapositive est recouverte d’anticorps qui lient soit un marqueur spécifique à l’exosome ou spécifique à la maladie, exprimé sur la surface de l’exosome, afin de capturer directement les exosomes cibles présents dans les échantillons plasmatiques ou sériques de faible volume appliqués aux puits sur le glisser. Les exosomes capturés sont ensuite hybridés avec un nanoparticules conjugué aux anticorps qui reconnaît le biomarqueur de l’intérêt sur ces exosomes, qui peut être soit un marqueur exosome général, soit un facteur spécifique pour un sous-type d’exosome d’intérêt. Les images de ces puits d’échantillonnage sont ensuite capturées à l’aide d’un microscope à champ sombre (DFM) et analysées pour mesurer la lumière diffusée à partir de nanoparticules liées à des exosomes d’intérêt capturés dans chaque échantillon puits6,16,17. En particulier, l’imagerie d’un puits d’échantillonnage entier par DFM à faible grossissement (LMDFM) évite un biais de sélection rencontré avec des analyses DFM à grossissement élevé lorsque les utilisateurs doivent choisir directement les champs à capturer pour une analyse d’image ultérieure. L’analyse d’image LMDFM est sujette à des artefacts de dispersion de la lumière des irrégularités de surface, y compris les rayures et les débris d’échantillon, mais ce fond peut être réduit en utilisant un algorithme simple de réduction du bruit que nous avons développé pour fonctionner sur le programme d’analyse d’image NIH, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Cet algorithme applique d’abord un seuil de contour d’entrée qui est utilisé pour détecter les limites du puits de l’échantillon pour définir la région de l’image pour une analyse ultérieure. La région définie par cette zone de contour est ensuite divisée en un signal distinct présent dans les canaux rouge, bleu et vert de l’image et le canal bleu est soustrait du canal rouge pour supprimer le signal provenant des artefacts de surface et de l’éclairage irrégulier de nanotige signal.

Cet article décrit comment utiliser ce dosage pour quantifier rapidement soit des niveaux totaux ou spécifiques d’exosome dans des échantillons plasmatiques ou sériques.

Protocol

1. préparation des sondes de nanoparticles Note: ce dosage utilise des nanorods d’or fonctionnalisés (aunrs; 25 nm de diamètre x 71 nm de longueur) qui sont conjugués façon covalente avec des polymères de neutravidine (AV) et ont un pic de résonance de Plasmon de surface qui produit un signal de diffusion rouge (641 Nm crête) sur DFM illumination. Laver 40 μL d’AuNR-AV (2,56 x 1011 particules) trois fois avec 200 ΜL de PBS (pH 7,0) par centrifugation et aspiration (8 500 x g à 4 ° c pendant 10 minutes), suivie d’une centrifugation finale et d’une étape d’aspiration après laquelle le granule aunr-AV est suspendu en 40 μL de PBS. Mélanger cette suspension AuNR-AV avec 10 μL d’anticorps biotinylés (0,5 mg/mL) spécifique pour un antigène à la surface du sous-type d’intérêt exosome et 150 μL de PBS, puis mélanger à 4 ° c pendant 2 h à l’aide d’un mélangeur pour permettre la fixation de la neutravidine-biotine pour atteindre l’achèvement. Laver les AuNRs (AuNR-IgG) conjugués par anticorps résultant trois fois par centrifugation et par aspiration (6 500 x g à 4 ° c pendant 10 minutes), puis les suspendre dans 200 ΜL de PBS et les entreposer à 4 ° c jusqu’à leur utilisation.Remarque: la technique stérile et les temps de stockage courts doivent être utilisés pour éviter la contamination et la dégradation de l’AuNR-IgG. Il est préférable d’utiliser des AuNRs conjugués aux anticorps dans les 24 heures suivant leur conjugaison. 2. préparation des diapositives de capture EV Diluer les anticorps de capture d’exosome sélectionnés à 0,025 mg/mL dans le PBS et ajouter 1 μL/puits de cette dilution sur une glissière A/G de protéine multi-puits, puis incuber cette lame à 37 ° c pendant 1 h dans une chambre humidifiée pour permettre la liaison d’anticorps de capture à la protéine A/G immobilisée sur la diapositive. Aspirer les puits pour éliminer les anticorps non liés et laver les puits trois fois par addition et aspiration de 1 μL/puits de PBS, puis charger chaque puits avec 1 μL de tampon bloquant (voir tableau des matériaux) et incuber la glissière pendant 2 h à 37 ° c dans une chambre humidifiée pour b verrouiller les autres sites de fixation des protéines. Aspirer les puits pour enlever le tampon bloquant, laver les puits trois fois par l’addition et l’aspiration de 1 μL/puits de PBS, et utiliser immédiatement les glissières bloquées pour la capture et l’analyse des exosome. 3. préparation de la courbe standard Pour quantifier précisément l’abondance absolue ou relative d’un sous-type spécifique d’exosome, l’utilisateur doit générer une courbe standard avec une population exosome pure qui exprime uniformément le biomarqueur de surface exosome d’intérêt. Cette étude analyse l’abondance des exosomes exprimant une protéine membranaire associée à une métastase, le récepteur de l’éphrine a2, qui a une relation rapportée avec le stade du cancer pancréatique et le pronostic6,18.NOTE: la lignée de cellules cancéreuses pancréatiques humaines PANC-1 et ses exosomes sont connues pour exprimer cette protéine et les exosomes isolés de cette lignée cellulaire ont été utilisés pour générer une courbe standard pour quantifier le nombre d’exosomes qui expriment cette protéine dans l’exosome complexe Échantillons. Cellules de culture pendant 48 heures à 37 ° c dans des milieux de culture sans sérum pour permettre l’accumulation d’exosome dans les milieux, puis isoler les surnageants de culture cellulaire par centrifugation des cultures de suspension ou aspiration directe de milieux de culture à partir de cultures cellulaires adhérentes. Centrifugez le support recueilli à 2000 x g pendant 30 min pour enlever les débris et récupérer le surnageant. Filtrer le surnageant de culture clarifiée à l’aide d’une unité de filtration à faible teneur en protéines de 0,45 μm de capacité appropriée (p. ex. une unité de filtrage sous vide polyéther de 250 mL). Concentrer le filtrat résultant par centrifugation à 3200 x g à l’aide d’un système de filtre de limite de poids moléculaire nominal 100 000 à 250 μl de volume final. Recueillir le volume retenu de ce filtre, puis laver le filtre avec 200 μL de PBS, et combiner ce volume de lavage avec le volume d’échantillon d’exosome collecté. Centrifugez cet échantillon à 21 000 x g pendant 45 minutes et récupérez soigneusement le surnageant, en prenant soin de ne pas prélever de matière précipitée. Centrifuger le surnageant récupéré à 100 000 x g pendant 3 heures pour précipiter les exosomes. Aspirer le surnageant et recueillir le culot exosome dans 100 μL de PBS. Conserver les suspensions exosome obtenues à 4 ° c si elles sont utilisées dans les 24 heures ou à-80 ° c pour un entreposage à long terme.Remarque: ne pas soumettre d’échantillons d’exosome pour répéter les cycles de gel-dégel. Quantifier une aliquote de la suspension exosome après mélange par mesurage direct de nombres exosome (par exemple, par analyse de suivi des nanoparticules ou par détection d’impulsions résistives réglables ou par mesure de la concentration protéique des lysats exosome par micro-bicinchoninique dosage de l’acide, ou une méthode équivalente, comme moyen d’estimer la quantité d’exosome)16,19. Générez un ensemble de dilutions sérielles de la suspension d’exosome pour permettre la comparaison du signal de nanoparticules à l’entrée du nombre exosome ou de la teneur en protéines. Transférer 1 μL de chaque étalon exosome à chacun de ses puits répliqués sur la plaque de dosage.Remarque: les courbes standard peuvent être utilisées pour calculer la pente de la ligne de corrélation entre le signal de nanoparticules et la concentration d’exosome à (1) évaluer la performance du dosage et (2) déterminer la concentration relative des exosomes cibles dans les échantillons expérimentaux. 4. traitement des échantillons plasmatiques ou sériques humains Prélever des échantillons de plasma ou de sérum par des méthodes standard et conserver à-80 ° c jusqu’à ce que nécessaire pour l’analyse exosome. Décongeler rapidement les échantillons dans un bain d’eau à température ambiante. Mélanger à plusieurs reprises les échantillons décongelés par inversion pour favoriser une suspension homogène.NOTE: les résultats des échantillons de sérum et de plasma peuvent ne pas être équivalents, car il y a une libération importante d’exosomes pendant la réaction de coagulation. Centrifuger les échantillons de plasma ou de sérum à 500 x g pendant 15 min pour précipiter les agrégats protéiques et autres débris. Transférer une aliquote de l’échantillon de plasma ou de sérum dans un tube frais et ajouter du PBS pour générer une dilution 1:1. Mélanger l’échantillon dilué par Vortex doux ou par inversion, selon le cas. Transférer 1 μL de chaque suspension plasmatique ou sérique dans chacun de ses puits répliqués sur la plaque de dosage. 5. capture et détection d’exosome Chargez les puits d’une glissière de capture EV bloquée avec 1 μL/puits d’échantillon d’exosome, en utilisant 8 répétitions par échantillon, et incubez la diapositive pendant la nuit à 4 ° c dans une chambre humidifiée. Aspirer tous les puits d’échantillonnage, puis ajouter 1 μL/puits de PBS pour laver les puits et enlever les exosomes non liés et autres contaminants de l’échantillon d’exosome chargé. Charger les puits d’échantillonnage avec 1 μL/puits d’une suspension AuNR-IgG préalablement préparée (voir section 1 ci-dessus) et incuber la glissière pendant 2 h à 37 ° c dans une chambre humidifiée. Aspirer la solution de nanoparticules et laver la lame en PBS additionnée de 0,01% de Tween-20 (PBST) pendant 10 min à l’aide d’un mélangeur, puis aspirer et laver tous les puits d’échantillonnage avec de l’eau désionisée pendant 10 min à l’aide d’un mélangeur rotatif et sécher à l’air pour les images ultérieures de LMDFM.NOTE: les coefficients de variation inter-essais (CVs) sont évalués à partir de huit répétitions du même échantillon. Les échantillons qui présentent des CV > 20% sont considérés comme non informatifs et devraient être répétés, s’il y a suffisamment d’échantillons. 6. capture d’image DFM Capturer des images pour la quantification d’exosome sous un éclairage cohérent à l’aide d’un appareil photo numérique attaché à un microscope équipé d’un condenseur à champ sombre (1,2 < NA < 1,4) et d’un objectif 4x employant une durée d’exposition de 1/220 s. Ouvrez le logiciel de capture d’image.Remarque: nous utilisons le logiciel d’imagerie de microscope NIS-Elements (voir le tableau des matériaux) pour le protocole décrit ci-dessous, mais il est possible d’utiliser un autre logiciel qui peut correspondre à ses paramètres de capture d’image. Le logiciel d’imagerie NIS-Elements Viewer est un programme autonome gratuit pour afficher les fichiers d’image et les jeux de données qui contiennent des outils d’analyse, de visualisation et d’archivage. Les paramètres ci-dessous sont également pour un microscope avec autofocus et une étape automatisée qui permet à plusieurs images d’être automatiquement capturées et cousues dans une seule image. Placez la glissière à l’envers au niveau du microscope, ajustez la position de la glissière et appliquez une petite goutte d’huile à immersion à l’arrière de la glissière, où l’objectif du condenseur contacte la glissière. Cliquez sur le bouton Live dans l’interface du logiciel, et réglez le temps d’exposition par rapport à une norme de concentration élevée bien pour s’assurer que l’image n’est pas saturée. Ouvrez la fenêtre numériser grande image à partir de l’onglet acquérir et définissez les paramètres de l’interface logicielle comme suit: macro image optique conf = Current; Objectif: 2:10x, balayage optique conf = courant, objectif: 2:10x; Chevauchement de coutures = 20%; Coutures via = chemin optimal. Choisissez Create large image, fermez l’obturateur actif pendant le mouvementde la scène, attendez avant chaque capture: 20 ms, focus manuellement au début, et Utilisez le focus étape par étape tous les 20 champs. Ces paramètres seront sauvegardés avec les images numérisées. Déplacez l’étape du microscope pour définir les limites inférieures gauche en haut à droite du champ de numérisation cible. Ajustez la mise au point pour obtenir une image claire sur le moniteur et ajustez les paramètres du condenseur et l’éclairage environnemental si nécessaire pour minimiser les irrégularités d’éclairage dans l’image ciblée. Nommez le fichier de sortie d’image dans le logiciel. Cliquez sur le bouton numériser et laissez le microscope numériser et créer et enregistrer une image cousue de la diapositive entière. Ouvrez l’image enregistrée avec le logiciel de capture d’image que vous utilisez et enregistrez-la à l’échelle 1/8 pour une analyse ultérieure sur le plugin DSM dans ImageJ. 7. analyse d’image DFM Téléchargez le programme ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Installez le plugin d’algorithme DSM dans ImageJ en utilisant les instructions répertoriées à https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually. Ouvrez le logiciel ImageJ, puis définissez les paramètres d’entrée suivants dans l’algorithme DSM: seuil de contour (CT) = 253,020, type = rouge, échelle (S) centrale = 0,8, limite de quantification basse (LT)/haute (HT) = 0/62. Ouvrez l’image enregistrée à partir de la section 6,8 avec ImageJ. Choisissez le bouton Scan DSM dans l’onglet plugins , puis définissez le nombre de colonnes et de lignes en fonction de l’image ouverte. Le programme peut reconnaître les zones de détection et l’analyse de l’intensité de dispersion de nanoparticules dans les zones d’après automatiquement. Définissez les paramètres d’entrée suivants dans la fenêtre DSM Scan : redimensionner le pourcentage = 25, diamètre du spot (en pixels) = 190 – 200, plage de diamètre = 32, diamètre d’incrément (en pixels) = 8, configuration DSM-faible Limit = 0, limite élevée = 62, distance adjacente = 100, soustraction du biais = 0.NOTE: les résultats de l’intensité de dispersion des nanoparticles reflètent la quantité d’exosomes liés sur la diapositive.

Representative Results

Les lames enrobées de protéine A/G (figure 1a) ont été fonctionnalisées avec un anticorps anti-EPHA2 puis utilisées pour capturer spécifiquement des exosomes EPHA2-positifs à partir d’échantillons sériques de patients avec et sans cancer pancréatique (1 μl/puits) et incubés avec des nanotiges d’or conjugués avec un anticorps anti-CD9 (figure 1b). Des images DFM de lumière dispersées de ces nanoparticules ont été analysées en utilisant le plugin DSM dans le logiciel ImageJ pour quantifier les exosomes positifs EphA-2 liés dans chaque puits. L’algorithme DSM définit automatiquement la limite d’un puits d’échantillonnage, filtre le bruit des artefacts, calcule le signal dispersé de chaque puits et génère ces informations (figure 2). L’algorithme DSM atténue fortement les artefacts de diffusion de la lumière à partir des rayures ou des débris présents dans l’échantillon et améliore la sensibilité et la reproductibilité de la détection des nanopartifices et peut traiter automatiquement un lot d’images de diapositives pour un débit élevé utiliser. Cet algorithme utilise les commandes ImageJ et les paramètres d’entrée par l’utilisateur pour soustraire l’arrière-plan de l’image, calculer le signal de diffusion de chaque puits et générer un fichier de données et d’image (figure 3). Les régions d’intérêt sont définies par les limites de puits de haute intensité dans l’image de capture en utilisant la fonction de seuil de contour du programme de macro ImageJ. Les analyses d’images utilisent un seuil prédéfini de contour et des paramètres d’image pour calculer l’intensité de la dispersion des nanoparticles pour chaque puits. Comme indiqué dans nos travaux précédents (renseignements supplémentaires de Liang et coll.6), les exosomes isolés des cultures cellulaires de Panc-1 caractérisées par la microscopie électronique à transmission et la tache occidentale présentaient la gamme de taille, la morphologie et le marqueur protéique expression cohérente avec un échantillon d’exosome de haute pureté. Les exosomes PANC-1, préparés avec la même procédure que nos travaux précédents, ont été utilisés ici pour valider notre dosage des NPE pour la quantification de l’exosome. Ce dosage a utilisé un anticorps anti-EphA2 pour capturer une grande population d’exosomes de la population exosome totale et un anticorps contre la protéine générale exosome CD9 pour détecter les exosomes capturés. Les résultats obtenus à l’aide d’échantillons d’exosome PANC-1 dilués en série, avec des concentrations protéiques variant de 0,24 à 1,2 μg/μL, ont montré une bonne reproductibilité dans les puits répliqués (figure 4a) et une forte corrélation linéaire entre la réponse de dispersion et la concentration de protéines exosome (figure 4b). Pour démontrer l’application potentielle de cette méthode, des échantillons sériques de patients avec ou sans cancer pancréatique ont été analysés afin de détecter l’abondance d’exosomes sériques exprimant le biomarqueur EphA2 associé au cancer, en utilisant un anticorps anti-EphA2 pour capturer directement les exosomes cibles à partir de sérum et de nanoparticules conjugués avec un anticorps anti-CD9 pour détecter les exosomes liés. Cette analyse a révélé que les échantillons sériques des patients atteints de cancer pancréatique avaient des niveaux significativement plus élevés d’exosomes EphA2 + (figure 5) que leurs témoins. Figure 1: schéma de quantification exosome. (A) schéma des lames A/G protéinées à plusieurs puits (192 puits) utilisées dans ce dosage. (B) les exosomes cibles sont directement capturés à partir d’échantillons, y compris le sérum et le plasma, par immobilisation de surface sur l’anticorps de capture (par exemple, anticorps anti-EPHA2) liés à la diapositive, puis incubés avec des nanotiges d’or conjugués avec une détection anticorps (p. ex. anticorps anti-CD9) avant analyse par analyse d’image DFM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2: quantification de l’exosome en appliquant l’algorithme DSM aux images LMDFM. Les images à faible grossissement sont traitées avec l’algorithme DSM pour éliminer le signal d’arrière-plan et les artefacts de signal qui peuvent résulter de rayures, de mélanges de vides, de débris et d’un éclairage d’échantillon irrégulier pour permettre une détection robuste du signal nanotige d’or, qui en corrélation avec la concentration d’exosome. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Sun, D. et coll. méthode de réduction du bruit pour quantifier la dispersion de la lumière de nanoparticle dans les images de champ lointain de microscope à faible grossissement. Chimie analytique. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) société chimique américaine. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3: schéma des commandes et des sorties de l’algorithme DSM. Les étapes indiquées utilisent des commandes natives d’ImageJ et tous les paramètres d’entrée sont sélectionnés en fonction des exigences des expériences via l’interface utilisateur graphique. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Sun, D. et coll. méthode de réduction du bruit pour quantifier la dispersion de la lumière de nanoparticle dans les images de champ lointain de microscope à faible grossissement. Chimie analytique. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) société chimique américaine. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4: images nPES LMDFM représentatives et données de sortie DSM. (A) image lmdfm d’un essai de NPE analysant un gradient de concentration d’exosomes de Panc-1 et (B) la corrélation linéaire du signal optique et de la concentration d’exosome de cette diapositive (de gauche à droite: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μL respectivement pour chaque colonne). Les données sont présentées en tant que moyenne ± SE, n = 6, avec un coefficient de corrélation de Pearson R2 = 0,99 et un coefficient de variation pour les répétitions de chaque concentration < 0,2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5: le signal LMDFM de EphA2+ exosomes diffère dans le sérum des patients avec et sans cancer pancréatique. Les échantillons sériques analysés par les NPE à l’aide d’un anticorps anti-EphA2 (associé au cancer) et d’un anticorps anti-CD9 (marqueur exosome général) ont montré une différence significative dans la concentration des exosomes EphA2 + dans les échantillons sériques des patients atteints et sans cancer pancréatique (N = 7/groupe). Les résultats sont présentés en moyenne ± SE. * *p = 0,002 par Mann-Whitney U-test (recto-verso). Ce chiffre a été modifié à partir de [Sun, D. et al. méthode de réduction du bruit pour quantifier la dispersion de la lumière de nanoparticle dans les images de champ lointain microscopiques à faible grossissement. Chimie analytique. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Les exosomes proviennent d’invaginations réglementées de la membrane endosome externe qui produisent des corps multivésiculaires, un sous-ensemble spécialisé d’endosomes qui contiennent un grand nombre de vésicules intraluminales qui subissent une fusion avec la membrane plasmique pour libérer la maturité exosomes dans l’espace extracellulaire. En raison de cette voie de biogenèse, les exosomes peuvent transporter des facteurs liés à la membrane associés à des fractions membranaires qui comprennent ou fusionnent avec la membrane endosome, ainsi que plusieurs types différents de composants cytosoliques, et contiennent donc des cargaisons de protéines, d’ADN et divers sous-types d’ARN (mRNA, microRNAs, RNAs à long non-codage) qui peuvent refléter le phénotype de leur cellule d’origine20. Étant donné que les exosomes sont sécrétés par la plupart sinon tous les types de cellules, peuvent présenter une augmentation de la sécrétion de cellules malades ou malignes, et s’accumulent dans la plupart des fluides corporels, les exosomes font l’objet d’une investigation exhaustive et systématique comme une promesse minimale des moyens invasifs pour détecter des pathologies spécifiques et surveiller leurs réponses au traitement21.

L’isolement d’exosome, qui est nécessaire pour la plupart des analyses exosome actuelles, est une procédure longue et intensive en main-d’œuvre, limitant la traduction clinique des biomarqueurs associés à l’exosome avec une pertinence médicale potentielle. De nombreuses méthodes d’isolement courantes (ultracentrifugation, taille-exclusion, précipitation, etc.) ne distinguent pas assez souvent les exosomes (30 – 100 nm) des micro-vésicules (100 – 1000 nm) et des corps apoptotiques (100 – 5000 nm) en raison de chevauchements dans leurs gammes de taille ou Propriétés physiques ou peuvent endommager l’intégrité de l’exosome15. De nouvelles approches sont en cours d’élaboration qui peuvent permettre des analyses plus rapides de l’exosome, mais il n’est pas clair comment il peut être possible de mettre en œuvre un grand nombre de ces plateformes dans des contextes cliniques dus.

Dans ce rapport, nous présentons une nouvelle approche qui permet la quantification de l’exosome à haut débit à base de nanoparticles à l’aide d’images microscopiques de champ sombre à faible grossissement. Cette méthode ne nécessite pas de purification d’exosome, d’équipement dédié coûteux ou de nouvelle expertise technique et devrait donc être susceptible d’être traduite rapidement dans la plupart des milieux de recherche et cliniques. Notre dosage peut être appliqué pour quantifier précisément la concentration d’une population exosome cible portant un biomarqueur spécifique lorsque les résultats de l’analyse sont comparés à une courbe standard, puisque nos résultats montrent qu’il y a une forte corrélation linéaire (R2 = 0,99) entre la réponse optique et la concentration exosome. Pour démontrer le potentiel réel de cette approche, nous avons fourni des données où nous avons utilisé cette méthode pour quantifier la concentration d’un biomarqueur exosome associé au cancer pancréatique dans des échantillons sériques obtenus chez des patients avec et sans cancer pancréatique.

Dans LMDFM, le puits de l’échantillon entier est imagé pour éviter le biais de sélection trouvé dans les analyses DFM à fort grossissement, où les utilisateurs doivent choisir directement les champs d’échantillon à capturer pour l’analyse d’image ultérieure, mais est soumis à des artefacts de diffusion de la lumière de la surface irrégularités, y compris les rayures et les débris d’échantillon. Cet arrière-plan peut être réduit pour détecter le signal dérivé de l’exosome cible en utilisant notre algorithme de réduction du bruit DSM qui fonctionne sur le programme d’analyse d’image NIH, ImageJ, mais il faut toujours prendre soin d’éviter d’introduire de tels artefacts qui peuvent réduire la plage dynamique de le dosage.

Matériaux utilisés dans ce dosage:

Des lames multi-puits SuperProtein A/G contenant 1 μL/puits ont été achetées chez ArrayIt Corporation (AGMSM192BC). Des nanoparticules ont été obtenues à partir de Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/ml). Les images DFM ont été capturées avec un appareil photo numérique Nikon DiR2 attaché à un microscope Nikon TI-Eclipse, avec un éclairage cohérent et un temps d’exposition de 1/220 s. La lignée de cellules PANC-1 utilisée dans cette étude a été achetée à l’American Type Culture Collection.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le travail a été principalement appuyé par le financement de la recherche fourni par NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 et R21Al126361-01), la Commission de recherche biomédicale de l’Arizona (ABRC) Young enquêteur Award.

Materials

Eppendorf Repeater stream Fisher Scientific 05-401-040
Eppendorf Research plus Eppendorf 3120000011 0.1 – 2.5 µL, dark gray
Functionalized Gold Nanorods Nanopartz C12-25-650-TN-DIH-50-1 In vitro neutravidin polymer functionalization
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D
Incu-shaker 10L Benchmark Scientific H1010
Inverted Research Microscope Nikon Ti-DH With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage
NIS-Elements Nikon Microscope imaging software
Phosphate Buffered Saline (1X) GE Healthcare Life Sciences SH30256.02 HyClone
Protein A/G Treated Glass Substrate Slides Arrayit Corp. AGMSM192BC Premium microarray substrate
Q500 Sonicator Qsonica, LLC Q500-110 With standard probe (#4220)
Superblock blocking buffer Thermo Scientific
TWEEN 20 Sigma Life Sciences 9005-64-5
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Nanoplasmon-enhanced ScatteringNPESExosome AnalysisExosome PurificationBiomarker DetectionGold NanorodsAntibody ConjugationExosome CaptureLow-magnification Microscopy

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Wan, M., Amrollahi, P., Sun, D., Lyon, C., Hu, T. Y. Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes. J. Vis. Exp. (147), e59177, doi:10.3791/59177 (2019).
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