Универсальный метод для монтажа Arabidopsis оставляет для прижизненной покадровой изображений
Summary
Мы приводим простой и универсальный способ выполнения флуоресцентные жить изображений Arabidopsis thaliana листьев в течение длительного периода времени. Мы используем трансгенных растений Arabidopsis выражая флуоресцентные Репортер ген под контролем промотора, связанных с иммунитетом в качестве примера для пространственно-временных понимания растений иммунных реакций.
Abstract
Завод иммунного ответа, связанный с геном общесистемной transcriptional перепрограммирования инициируется в месте инфекции. Таким образом иммунный ответ регулируется пространственном и временном отношении. Использование флуоресцентных гена под контролем промотора связанных с иммунитетом в сочетании с автоматизированной флуоресцентной микроскопии является простой способ понять пространственно-временных регуляции иммунитета растений. В отличие от корня тканей, которые были использованы для целого ряда различных прижизненной флуоресцентных изображений экспериментов существуют примеры флуоресцентные жить изображений для тканей листа, которые сталкиваются массив бортовых микробной инфекции. Поэтому мы разработали простой метод для монтирования листья Arabidopsis thaliana растений для живой клетки изображений в течение длительного периода времени. Мы использовали трансгенные растения арабидопсис , выражая желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) genefused на ядерной локализации сигнал (NLS) под контролем промотора гена оборонной маркер, Pathogenesis-Related 1 ( PR1). Мы проникли трансгенных лист с псевдомонас pv. помидор DC3000 (avrRpt2) напряжение (Pst_a2) и осуществляется в естественных условиях промежуток времени визуализации рекламы ЯФП сигнала для в общей сложности 40 h, с использованием автоматизированных флуоресценции стереомикроскопом. Этот метод может быть использован не только для исследования на завод иммунные реакции, но и для анализа различных мероприятий в области развития и окружающей среды реакций, происходящих в тканях листа.
Introduction
Иммунную систему растений включает в себя динамический transcriptional перепрограммирования регулируется несколькими транскрипции факторы, а также фитогормонов1. Накопление данных транскриптом предоставляет возможности для сбора информации о иммунной системы растений: например, структура сети сигнализации каскады2. Однако наши знания о пространственной и временной динамизм иммунитета растений по-прежнему ограничены3,4,5.
В предыдущих исследованиях пространственно-временных регуляцию экспрессии генов, связанных с обороны главным образом проанализирован с помощью гибридизации in situ и β-глюкуронидазы (GUS) репортер пробирного6,,78. Эти методы позволяют нам визуализировать transcriptional активации различных генов интерес на местах. Однако эти процедуры требуют химической фиксации образцов и таким образом привести к потере всей временной информации. Биологическая события, такие как иммунитет, прогресс с течением времени. Использование Люцифераза как репортер позволило захвата временной динамики промоутер интерес3. Однако на основе Люцифераза пробирного требует дорогих субстрата и очень чувствительных детекторов. Чтобы увеличить наше понимание пространственно-временных аспектов растений иммунного ответа с помощью простой процедуры, мы создали трансгенных Arabidopsis thaliana растений, выражая желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) ген сливается с сигнал (рекламы ЯФП-NLS) ядерной локализации под контролем промотора гена оборонной маркер, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Мы использовали хлорофилл аутофлюоресценция, маркер живых клеток, чтобы захватить процесс запрограммированная смерть клетки (PCD), которая часто происходит во время эффекторных срабатывает иммунитета (ETI), форма иммунитета растений, вызванных конкретного возбудителя инфекции9 , 10. Мониторинг временная динамика интенсивности флуоресценции сигнала в свободно движущихся объектов, таких как живущих листья Arabidopsis , требует сложной обработки изображений программное обеспечение либо построенных собственными силами или имеющиеся коммерчески. Кроме того предотвращая перемещение образцов представляет собой простой метод для решения этого вопроса. Здесь мы разработали универсальный и простой метод для монтажа живущих листья трансгенные растения арабидопсис для долгосрочного наблюдения под стереомикроскопом автоматизированной флуоресценции. Метод позволяет нам захватить промоутер, листья динамика в почве выросли нетронутыми завода в течение нескольких дней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим простой метод для монтирования гостиной Arabidopsis лист, выражая флуоресцентные Репортер ген под контролем промотора интерес для долгосрочного наблюдения с использованием автоматизированной флуоресцентные стереомикроскопом. Промежуток времени изображения флуоресцентных репортер был часто выступал в тканях корня; Однако только несколько аналогичные исследования были проведены в тканях листа. Это, скорее, потому что листья имеют возможность свободно перемещаться в пространстве, в то время как корни часто похоронены и исправлена в средне твердой агар.
В настоящем докладе мы сосредоточились на пространственно-временных динамика pPR1 активности во время ETI, индуцированных Pst_a2. В дополнение к нежным фиксации листа, подробно говорилось выше важно четко визуализировать пространственно-временных динамику клеточного событий, таких как промоутер активации и PCD. Если не резкое различие между ячейками, показывая pPR1 активности и PCD, убедитесь, что все из межклеточного пространства в районе проникли полностью заполнены с подвеской возбудителя (см. шаг 2.4). Это очень важно при использовании стереомикроскопов флуоресценции поля, поскольку эти Микроскопы захватить все обнаруживаемые сигналы вдоль же вертикальное положение образца. Хлорофилл аутофлюоресценция из живых клеток выше или ниже клетки PCD домена легко маски выставке не аутофлюоресценция мертвые клетки. Это также верно для рекламы ЯФП сигнала.
Условия для покадровой изображений необходимо будет тщательно через несколько предварительных экспериментов в различных экспериментальных условиях. Параметры для покадровой изображений зависит от нескольких факторов, таких как микроскопические системы, трансгенных растений и патогенов. Чтобы получить эти параметры, мы сначала проанализировал различные воздействия раз для рекламы ЯФП интенсивности сигнала в проникли листьев на 7 ХПИ, который почти совпадает с первоначальной активации pPR1. 5 s экспозиции было определено как подходящие для захвата сигнала рекламы ЯФП с стереомикроскопом, используемые в данном исследовании. Подобный тест был проведен для визуализации аутофлюоресценция хлорофилла. Воздействие образца света между интервалами 3 мин был запрограммирован в программу покадровой изображений как нормальный светлые области изображения с максимальной выдержка. Наша система (Таблица материалов) позволило нам иметь 2,5 мин помимо рекламы ЯФП, TXR и светлые области изображения. Это ограничение было основной причиной для выбора интервала 3 мин. Далее мы подтвердили, что этот промежуток времени условие вызвало без видимых повреждений на образцы растений и не вызывать внематочной света стрессом активации pPR1 (Рисунок 3B, C). Это привело к разработке программы, используемые в данном исследовании. Таким образом, 3-мин интервалами флуоресценции изображений были сочтены достаточными для захвата pPR1 динамика во время Pst_a2-опосредованной ETI9.
Промоутер репортер конструкций, особенно с флуоресцентные репортер, сливается с NLS, использовались многими группами, и легко доступны от исследовательского сообщества; Мы использовали конструкции, опубликованной Кубо et al. 13. Таким образом, протокол, описанные здесь может использоваться в любом исследовании биологии растений, изучение тканей листа, если соответствующие трансгенных растений доступны. Наш простой и простой протокол предоставляет большие возможности для исследователей, которые хотят анализ пространственно-временных динамики любых биологических событий, происходящих в листья, таких как иммунного ответа. Вполне вероятно, что наш метод, с помощью кусков ленты вызывает небольшой физический стресс на образцы. Однако этот вопрос можно контролировать, включив соответствующие позитивные и негативные элементы управления, например макет лечения, в экспериментах (рис. 3C). Экспериментальных условий может быть далее изменена и оптимизирована путем анализа этих элементов в различных условиях.
В последние годы быстрое развитие изображений инструментов и методов стимулировало интерес исследователей в сложных пространственно-временных аспектов биологических событий. В любых изображений анализа соответствующие крепления и фиксации образцов являются одним из наиболее важных вопросов. Простой и универсальный метод монтажа жизни листья Arabidopsis разработан в этом исследовании можно применять и оптимизирована для различных изображений экспериментов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Японии науки и техники Агентство [PRESTO117665 с.б., ERATOJPMJER1502 н.н.] и японского общества для содействия развитию науки (дотаций для исследовательской деятельности начального [22880008 с.б.] и [молодых ученых (B) 23780040 для с.б.]). Мы благодарим A. Senzaki, ю. Судзуки, ю. Sugisawa и э. Betsuyaku за отличную техническую помощь, J. Паркер для обеспечения Pst_a2 деформации и т. Демура для предоставления вектора pBGYN.
Materials
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
References
- Tsuda, K., Somssich, I. E. Transcriptional networks in plant immunity. New Phytologist. 206 (3), 932-947 (2015).
- Mine, A., Sato, M., Tsuda, K. Toward a systems understanding of plant-microbe interactions. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
- Murray, S. L., Thomson, C., Chini, A., Read, N. D., Loake, G. J. Characterization of a novel, defense-related Arabidopsis mutant, cir1, isolated by luciferase imaging. Molecular Plant-Microbe Interactions. 15 (6), 557-566 (2002).
- Spoel, S. H., Johnson, J. S., Dong, X. Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (47), 18842-18847 (2007).
- Asai, S., Shirasu, K. Plant cells under siege: plant immune system versus pathogen effectors. Current Opinion in Plant Biology. 28, 1-8 (2015).
- Schmelzer, E., Kruger-Lebus, S., Hahlbrock, K. Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression around Sites of Attempted Fungal Infection in Parsley Leaves. The Plant Cell. 1 (10), 993-1001 (1989).
- Ohshima, M., Itoh, H., Matsuoka, M., Murakami, T., Ohashi, Y. Analysis of stress-induced or salicylic acid-induced expression of the pathogenesis-related 1a protein gene in transgenic tobacco. The Plant Cell. 2 (2), 95-106 (1990).
- Rushton, P. J., Reinstädler, A., Lipka, V., Lippok, B., Somssich, I. E. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. The Plant Cell. 14 (4), 749-762 (2002).
- Betsuyaku, S., et al. Salicylic Acid and Jasmonic Acid Pathways are Activated in Spatially Different Domains Around the Infection Site During Effector-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 59 (1), 8-16 (2018).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature Reviews Genetics. 11 (8), 539-548 (2010).
- Katagiri, F., Thilmony, R. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. , (2002).
- Zeier, J., Pink, B., Mueller, M. J., Berger, S. Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation. Planta. 219 (4), 673-683 (2004).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes & Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
