Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

Nota: É importante impedir o sono movimento de vida folha amostras durante a imagem latente de lapso de tempo. Para minimizar o estresse mecânico nas folhas, fixação suave de folhas é necessária. Apenas amostras de folha devidamente preparado produzem imagens lapso de tempo apropriadas para várias análises de imagem. Um protocolo utilizando plantas transgênicas de Arabidopsis expressando YFP-NLS fusão sob o controle do promotor do gene de PR1 (plantas pPR1-YFP-NLS) e Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 estirpe (avrRpt2) (Pst_a2) é descrito abaixo como um exemplo. 1. preparação de plantas e patógenos Encha uma bandeja de plugue plástico celular (Tabela de materiais) com o solo autoclavado. Semear uma semente de Arabidopsis transgênica por célula (Figura 1A). A bandeja de transferência para uma sala de crescimento, a 23 ° C e crescer as plantas sob luz branca contínua durante 2-3 semanas. Dois dias antes da inoculação do patógeno, raia Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 avrRpt2 Coe (Pst_a2) de um estoque de glicerol para NYG médio (peptona 5g/L, 3 g/L de extrato de levedura, glicerol 20 mL/L, ágar bacteriológico de 15 g/L, pH 7,0) contendo 100 mg/L rifampicina e 50 mg/L canamicina e incubar a 28 ° C, por 48 h. Colheita das células bacterianas que aparecem na superfície do meio usando pontas de plástico, transfira para um tubo de plástico contendo 10 mM MgCl2e ressuspender. Medir a densidade óptica (OD) da solução em 600 nm (OD600). Ajustar a concentração celular final de células bacterianas para 108 unidades formação de Colônia (UFC) / mL, que corresponde normalmente ao OD600 = 0,211. 2. inoculação do patógeno Corte com cuidado uma ficha de célula que contém uma planta de 2-3-semanas sem danificar a planta. Defina a célula em uma bandeja de plug de célula vazia (2 x 2 células são suficientes) para manter um bom equilíbrio (Figura 1B). Selecione uma folha visivelmente saudável para inoculação. Geralmente, o terceiro, quarto e quinto deixa (#3, #4 e #5, respectivamente, na Figura 1C) da parte inferior da planta são fáceis de manusear. Uso deixa na mesma posição em um conjunto de experiências para melhor reprodutibilidade. Água no solo a planta antes da inoculação para a imagem latente de lapso de tempo a longo prazo. Opcionalmente, no caso de análise de stress-responsivo promotores como pPR1, para garantir que as plantas não são naturalmente estressadas, examine as folhas sob um microscópio de fluorescência, antes da inoculação do patógeno para verificar a ausência de sinal YFP. Excluir deixa apresentando YFP sinal do experimento. Use luvas de látex descartáveis antes de infiltração para evitar o contacto directo com o patógeno. Utilizando uma seringa de 1 mL no plástico, cuidadosamente infiltrar o lado abaxial da folha com a suspensão bacteriana (108 UFC/mL)11 (Figura 1D). Inoculação de uma pequena porção na metade da folha permite uma boa visualização de atividade pPR1 ; a área infiltrada torna-se visível como cor em comparação com a restante folha verde mais escuro. Tenha muito cuidado para não causar danos mecânicos à folha durante a infiltração.Nota: Certifique-se de que todos os espaços intercelulares na área infiltrada são completamente cumprida (verticalmente) com a suspensão do patógeno; caso contrário, o domínio PCD será difícil Visualizar sob o microscópio fluorescente. Isso simplesmente pode ser confirmado pela conclusão do greening escuro na área infiltrada. Absorva o excesso de suspensão bacteriana da área circundante a seção infiltrada da folha infiltrada com uma toalha de papel macio. 3. montagem da folha inoculada Imediatamente após a inoculação, corrigi uma lâmina de vidro sobre a bandeja plástica usando fita cirúrgica (Tabela de materiais), tal que a folha infiltrada está localizada no centro da lâmina de vidro. Certifique-se de que a lâmina de folha inoculada é completamente montada dentro da lâmina de vidro(Figura 2). Preparar duas camadas de fita plástica (no caso da fita grossa de 0,2 mm, consulte Tabela de materiais) e corte-o em duas partes (Figura 2B; partes 1 e 2) para caber os espaços ao longo do pecíolo da folha infiltrado. Organize o comprimento dessas duas peças, indicado com uma seta com duas pontas na Figura 2B, para se encaixar o comprimento da seta de duas pontas, mostrado na Figura 2.Nota: Cortar um canto de cada uma das duas peças ajuda a evitar danos à lâmina da folha (Figura 2B, setas; ver também passo 3.4 abaixo). Qualquer tipo de fita plástica com espessura similar é apropriado para fazer uma ponte sobre o pecíolo. A rigidez da fita plástica é importante para fácil manuseio durante o procedimento descrito abaixo. Usando um par de pinças bem, fica pedaços de fita 1 e 2 de cada lado do pecíolo espinhoso, tal que os cantos cortados de cada peça alinharem com a base da lâmina da folha (Figura 2C). Certifique-se de que os pedaços de fita não toque a lâmina pecíolo ou folha.Nota: Estas peças de duas camadas de fita plástica na base da lâmina da folha agem como espaçadores e evitar estresse físico sobre o pecíolo durante a montagem. Preparar um dispositivo adicional de duas camadas de fita plástica (Figura 2B, parte 3) para ajustar o tamanho da seta de duas pontas em Figura 2B e colá-la em cima os pedaços de fita 1 e 2 para formar uma ponte sobre o pecíolo ( Figura 2D, E). Tenha muito cuidado para não pegar a lâmina pecíolo e folha diretamente entre os pedaços de fita em posições indicadas com setas na Figura 2D, E. Delicadamente enfiar um pequeno pedaço de fita cirúrgica (Figura 2-F, peça 4) sobre a lâmina de vidro acima da ponta da lâmina da folha para que a lâmina da folha é fixada muito suavemente sobre a lâmina de vidro. Apenas Pressione firmemente para baixo a parte da fita cirúrgica diretamente tocando a lâmina de vidro (Figura 2F, área delineada com uma linha tracejada vermelha), não a outra parte sobrejacente a folha. Delicadamente enfiar outro pequeno pedaço de fita cirúrgica (Figura 2G, peça 5) na borda do pecíolo espinhoso e pedaços de fita plástica (1, 2 e 3) para que o pecíolo é muito suavemente fixado a lâmina de vidro e o plástico fita peças. Só firmemente fixar a parte da fita cirúrgica diretamente tocando a lâmina de vidro para a lâmina de vidro e pedaços de fita plástica (Figura 2G, área delineada com uma linha tracejada vermelha), não a outra parte sobrejacente do pecíolo. Evitar que folhas vizinhas movendo-se para o campo de visão do microscópio usando pontas de pipetas 200 µ l (Figura 2H). Insira as pontas de pipetas no solo para segurar suavemente as folhas vizinhas longe da folha infiltrada. Tenha cuidado para não inserir as pontas muito profundo no solo para evitar dano possível raiz.Nota: A planta preparada agora está pronta para a imagem latente de microscópio de fluorescência. 4. observação microscópica de lapso de tempo Ligue o microscópio fluorescente.Nota: Aqui, um estereomicroscópio automatizado equipado com um altamente sensível monocromático de 1,4 megapixels câmera digital no modo de 12 bits é usada (Tabela de materiais). O microscópio deve ser colocado em um quarto escuro, equipado com uma unidade de ar condicionado ou em um armário escuro com ventilação adequada para manter a temperatura ambiente a 23 ° C durante a imagem latente de lapso de tempo. Defina a planta no espaço acima sob a lente objetiva do microscópio estereoscópico para a imagem latente. Configurar os parâmetros para a imagem latente de lapso de tempo (veja exemplos na tabela 1). Certifique-se de etapas de programa para a exposição à luz durante o período de intervalo de imagens lapso de tempo, desde que a luz tem um impacto importante na planta imunidade12. Use o filtro YFP convencional (excitação 500-520 nm; emissão 540-580 nm) para visualizar o sinal YFP. Use o filtro vermelho Texas (TXR) (excitação 540-580 nm; passe longo de emissão 610 nm) para visualizar a autofluorescência de clorofila, para que o domínio PCD é visível como uma área escura (sem autofluorescência) rodeada por YFP-positivo de camadas de célula9 (Figura 3 ). Use a configuração convencional de campo epi-brilhante para obter etapas adicionais exposição à luz.Nota: Antes do experimento, medir o poder da fonte de luz brilhante-epi e ajustá-lo ao nível da condição de crescimento de planta própria. Execute o programa de geração de imagens lapso de tempo. Para observação de longo prazo durante vários dias, considere-se de molhar a planta adequadamente, por exemplo, durante as etapas de exposição à luz. Após a aquisição da imagem, omita canais extras usados para exposição à luz nos intervalos (correspondendo a 3-8 de canaletas na tabela 1) do conjunto de dados. Analise dados com vários métodos, como análise de região de interesse (ROI), usando o software de análise de imagem diferente como Fiji9.