Un metodo Versatile per il montaggio di Arabidopsis lascia per l'Imaging di time-lapse videomicroscopia
Summary
Segnaliamo un metodo semplice e versatile per l’esecuzione di live-imaging fluorescente di Arabidopsis thaliana foglie per un periodo prolungato di tempo. Usiamo una piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono un gene reporter fluorescente sotto il controllo di un promotore di immunità-correlati come esempio per acquisire spatiotemporal comprensione delle risposte immunitarie pianta.
Abstract
La risposta immunitaria di impianto connessa con un genoma di riprogrammare trascrizionale è iniziata presso il sito di infezione. Così, la risposta immunitaria è regolata spazialmente e temporalmente. L’uso di un gene fluorescente sotto il controllo di un promotore di immunità-relative in combinazione con un microscopio a fluorescenza automatizzato è un modo semplice per capire spatiotemporal regolazione dell’immunità di pianta. In contrasto con i tessuti di radice che sono stati utilizzati per un numero di vari esperimenti di imaging fluorescenti videomicroscopia, esistono alcuni esempi di vivere-imaging fluorescenti per i tessuti della foglia che incontrano una matrice delle infezioni microbiche nell’aria. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo semplice per montare le foglie delle piante di Arabidopsis thaliana per l’imaging di cellule vive per un periodo prolungato di tempo. Abbiamo utilizzato piante transgeniche di Arabidopsis esprimenti la proteina fluorescente gialla (YFP) genefused per il segnale di localizzazione nucleare (NLS) sotto il controllo del promotore di un gene marcatore correlate a difesa, Pathogenesis-Related 1 ( PR1). Abbiamo infiltrato una foglia transgenica con Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (avrRpt2) ceppo (Pst_a2) ed eseguito imaging in vivo time-lapse del segnale per un totale di 40 h utilizzando uno stereomicroscopio automatizzato fluorescenza YFP. Questo metodo può essere utilizzato non solo per gli studi sulle risposte immunitarie di pianta, ma anche per l’analisi dei vari eventi dello sviluppo e risposte ambientali che si verificano nei tessuti fogliari.
Introduction
Risposta immunitaria pianta comporta una dinamica riprogrammare trascrizionale regolata dalla trascrizione multipli fattori così come fitormoni1. L’accumulo di dati del trascrittoma fornisce opportunità per raccogliere informazioni sul sistema immunitario pianta: ad esempio, la struttura di rete di segnalazione a cascata2. Tuttavia, la nostra conoscenza del dinamismo spaziale e temporale dell’immunità pianta rimane ancora limitato3,4,5.
Negli studi precedenti, spatiotemporal regolazione dell’espressione genica correlate a defense è stato analizzato principalmente tramite l’ibridazione in situ e un β-glucuronidasi (GUS) reporter dosaggio6,7,8. Questi metodi consentono di visualizzare l’attivazione trascrizionale di diversi geni di interesse in situ. Tuttavia, queste procedure richiedono fissazione chimica degli esemplari e quindi causare la perdita di tutte le informazioni temporali. Eventi biologici, quali l’immunità, progressi nel tempo. L’uso della luciferasi come reporter ha permesso la cattura di dinamica temporale del promotore di interesse3. Tuttavia, basato su luciferase assay richiede un substrato costoso e altamente sensibile detector. Per aumentare la nostra comprensione degli aspetti spaziotemporali della risposta immunitaria pianta utilizzando una semplice procedura, abbiamo generato transgenici Arabidopsis thaliana piante esprimenti la proteina fluorescente gialla (YFP) gene fusa per la segnale di localizzazione nucleare (YFP-NLS) sotto il controllo del promotore del gene marcatore correlate a difesa, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. Abbiamo usato autofluorescence di clorofilla, un marcatore delle cellule viventi, di catturare il processo di morte cellulare programmata (PCD), che spesso si verifica durante attivato effettrici dell’immunità (ETI), una forma di immunità pianta indotta dal patogeno specifico infezione9 , 10. monitoraggio la dinamica temporale dell’intensità del segnale di fluorescenza in liberamente oggetti in movimento, come ad esempio living foglie di Arabidopsis , richiede un’immagine complessa elaborazione software integrato internamente o disponibile in commercio. In alternativa, impedendo lo spostamento di esemplari è un metodo semplice per risolvere il problema. Qui, abbiamo sviluppato un metodo semplice e versatile per il montaggio vivono foglie di una pianta Arabidopsis transgenica per l’osservazione a lungo termine sotto uno stereomicroscopio automatizzato fluorescenza. Il metodo permette di catturare il promotore dinamiche all’interno del terreno coltivato pianta intatta foglie sopra un paio di giorni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, segnaliamo un metodo semplice per montare un vivente Arabidopsis foglia che esprimono un gene reporter fluorescente sotto il controllo di un promotore di interesse per l’osservazione a lungo termine utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente automatizzato. Time-lapse imaging di un reporter fluorescente è stata eseguita frequentemente nei tessuti della radice; Tuttavia, solo pochi studi simili sono stati condotti nei tessuti fogliari. Questo è probabilmente perché le foglie sono in grado di muoversi liberamente nello spazio, considerando che le radici sono spesso sepolto e fissate nel terreno agar solido.
In questo rapporto, ci siamo concentrati sulla dinamica spazio-temporale di pPR1 attività durante ETI indotto da Pst_a2. Oltre la fissazione delicata della foglia descritta sopra, è importante visualizzare chiaramente la dinamica spazio-temporale degli eventi cellulari come attivazione del promotore e PCD. Se la distinzione tra cellule che mostrano attività pPR1 e PCD non è nitida, assicurarsi che tutti gli spazi intercellulari in zona infiltrato sono completamente riempiti con la sospensione dell’agente patogeno (Vedi punto 2.4). Questo è fondamentale quando si utilizza grandangolari stereomicroscopi poiché questi microscopi catturano tutti i segnali rilevabili lungo la stessa posizione verticale dell’esemplare. Autofluorescenza clorofilla dalle cellule sopravvissute di sopra o di sotto le cellule nel dominio PCD maschera facilmente le cellule morte che esibiscono nessun autofluorescence. Questo vale anche per il segnale YFP.
Condizioni per l’imaging di time-lapse necessario stabilire attentamente attraverso diversi esperimenti preliminari in diverse condizioni sperimentali. Parametri per l’imaging di time-lapse dipendono da diversi fattori quali il sistema microscopico, piante transgeniche e patogeni. Per ottenere questi parametri, abbiamo prima analizzato diversi tempi di esposizione per l’intensità del segnale YFP nella foglia infiltrata a 7 hpi, che quasi coincide con l’attivazione iniziale di pPR1. Un’esposizione di s 5 è stata determinata come appropriato per catturare YFP segnale con lo stereomicroscopio utilizzato in questo studio. Un test simile è stato effettuato per l’imaging autofluorescence di clorofilla. Esposizione dell’esemplare alla luce tra gli intervalli di 3 minuti è stato programmato nel time-lapse programma imaging come formazione immagine normale campo luminoso con tempo di esposizione massimo. Il nostro sistema (Tabella materiali) ci ha permesso di avere 2,5 min oltre YFP, TXR e campo chiaro imaging. Questo vincolo è stato il motivo principale per scegliere un intervallo di 3 min. Successivamente, abbiamo confermato che questa condizione di time-lapse non causato nessun danno apparente per i campioni di pianta e non ha indotto ectopico fotoattivazione sollecit-relativi di pPR1 (Figura 3B, C). Ciò ha condotto allo sviluppo del programma utilizzato in questo studio. Così, gli intervalli di 3 minuti di formazione immagine di fluorescenza sono stati ritenuti sufficienti per catturare pPR1 dinamiche durante Pst_a2-mediata ETI9.
Costruzioni del promotore-reporter, soprattutto con il reporter fluorescente fuso a NLS, sono stati utilizzati da molti gruppi e sono facilmente reperibile dalla comunità di ricerca; Abbiamo usato il costrutto pubblicato da Kubo et al. 13. così, il protocollo descritto qui può essere utilizzato in qualsiasi studio di biologia vegetale esaminando tessuti fogliari, se appropriati piante transgeniche sono disponibili. Il nostro protocollo semplice e facile fornisce una grande opportunità per i ricercatori che sono interessati ad analizzare la dinamica spazio-temporale di tutti gli eventi biologici che si verificano foglie, come la risposta immunitaria. È plausibile che il nostro metodo usando pezzi di nastro induce un lieve stress fisico sugli esemplari. Tuttavia, questo problema può essere controllato mediante l’inclusione di appropriati controlli positivi e negativi, come i trattamenti finti, negli esperimenti (Figura 3C). Le condizioni sperimentali possono essere ulteriormente modificate e ottimizzate analizzando questi controlli in condizioni diverse.
Negli ultimi anni, il rapido sviluppo di tecniche e strumenti di imaging ha stimolato l’interesse dei ricercatori per i complessi aspetti spaziotemporali eventi biologici. In ogni analisi di imaging, appropriato montaggio e fissaggio degli esemplari sono tra le questioni più importanti. Il metodo semplice e versatile di montaggio viventi che Arabidopsis lascia sviluppato in questo studio possa essere applicato e ottimizzato per vari esperimenti di imaging.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Japan Science and Technology Agency [PRESTO117665 a S.B., ERATOJPMJER1502 di N.N.] e dalla società per la promozione della scienza (localizzativi per l’avvio di attività di ricerca [22880008 a S.B.] e per giovani scienziati (B) [Giappone 23780040 a S.B.]). Ringraziamo r. Senzaki, Y. Suzuki, Y. Sugisawa ed E. Betsuyaku per l’eccellente assistenza tecnica, J. Parker per fornire il ceppo Pst_a2 e T. Demura per fornire il vettore di pBGYN.
Materials
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
References
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