שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ
Summary
אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.
Abstract
התגובה החיסונית צמח המשויך תעתיק הגנום כולו התכנות מאותחלת באתר של זיהום. לפיכך, התגובה החיסונית מוסדר במרחב של חנותם. השימוש של גנים פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות בשילוב עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות אוטומטיות הוא דרך פשוטה להבין ייתכן רגולציה של הצמח חסינות. בניגוד הרקמות שורש נעשה בהם שימוש במשך מספר intravital פלורסנט הדמיה ניסויים שונים, קיימים כמה דוגמאות הדמיה לחיות פלורסנט ברקמות עלה נתקל מערך של זיהומים חיידקים באוויר. לכן, פיתחנו שיטה פשוטה כדי לטעון עלים של צמחים תודרנית לבנה עבור הדמיה לחיות תאים על פני תקופה ארוכה של זמן. השתמשנו הטרנסגניים צמחים תודרנית לבטא את genefused צהוב חלבון פלואורסצנטי (YFP) לאות לוקליזציה גרעינית (שקל) תחת השליטה של האמרגן של גנים הקשורים להגנה סמן, Pathogenesis-Related 1 ( PR1). חדרנו עלה הטרנסגניים עם Pseudomonas syringae pv. עגבניות DC3000 (avrRpt2) זן (Pst_a2) וביצע ויוו הדמיה בצילום מואץ של האות YFP עבור סכום כולל של 40 h באמצעות stereomicroscope של קרינה פלואורסצנטית אוטומטית. יכול להיות מנוצל שיטה זו לא רק עבור מחקרים על תגובות חיסוניות הצמח, אלא גם עבור ניתוחים של התפתחותית ואירועים שונים התגובות סביבתיים המתרחשים ברקמות עלה.
Introduction
התגובה החיסונית צמח כרוך דינמי תעתיק התכנות מוסדר על ידי שעתוק מספר גורמים כמו גם phytohormones1. ההצטברות של נתונים transcriptome מספק הזדמנויות לאיסוף מידע על המערכת החיסונית צמח: לדוגמה, מבנה הרשת איתות מפלי2. עם זאת, הידע שלנו על הדינמיות יכולות של הצמח חסינות נשאר עדיין מוגבלת3,4,5.
במחקרים קודמים, ייתכן בקרת גנים הקשורים להגנה בעיקר נותחה באמצעות היברידיזציה וβ-glucuronidase (גאס) כתב assay6,7,8. שיטות אלה מאפשרים לנו לדמיין את הפעלת גנים ברמת השעתוק של גנים שונים עניין באתרו. עם זאת, הליכים אלה דורשים קיבוע כימי של דגימות, ובכך לגרום לאובדן כל המידע טמפורלית. אירועים ביולוגיים, כגון חסינות, התקדמות לאורך זמן. השימוש לוציפראז ככתב אפשרה לכידתו של הדינמיקה הטמפורלי של האמרגן של ריבית3. אולם, מבוססי לוציפראז וזמינותו מחייבת של המצע יקר וגלאים רגישים. כדי להגדיל את ההבנה שלנו של היבטים ייתכן של התגובה החיסונית צמח באמצעות הליך פשוט, יצרנו הטרנסגניים תודרנית לבנה צמחים לבטא את הצהוב חלבון פלואורסצנטי (YFP) הגן דבוקה לוקליזציה גרעיני אות (YFP-NLS) תחת השליטה של האמרגן של הגן סמן הקשורים להגנה, Pathogenesis-Related 1 (PR1)9. השתמשנו כלורופיל autofluorescence, סמן של תאים חיים, כדי ללכוד את תהליך מוות תאי מתוכנת (יהלומים), אשר מתרחשת לעתים קרובות במהלך המופעלות אפקטור חסינות (אתי), סוג של צמח חסינות הנגרמת על ידי זיהום פתוגן מסוים9 , 10. פיקוח על הדינמיקה הטמפורלי של קרינה פלואורסצנטית עוצמת האות ב בחופשיות הזזת אובייקטים, כגון חיים תודרנית עלים, דורש תמונה מורכבת עיבוד תוכנה שנבנו בתוך הבית או זמינים מסחרית. לחלופין, מניעת העברת דגימות היא שיטה פשוטה לפתרון הבעיה. . הנה, פיתחנו שיטה מגוונים ופשוטים להרכבת חי עלים של צמח תודרנית הטרנסגניים להשגחה לטווח ארוך תחת stereomicroscope קרינה פלואורסצנטית אוטומטית. השיטה מאפשרת לנו ללכוד את האמרגן הדינמיקה בתוך אדמה שגודלו צמח שלם משאיר על פני כמה ימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מדווחים על שיטה פשוטה כדי לטעון להתפרנס תודרנית העלה לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של אדם המקדם את עניין להשגחה לטווח ארוך באמצעות stereomicroscope פלורסנט אוטומטיות. הדמיה בצילום מואץ של עיתונאי פלורסנט בוצעה לעתים קרובות ברקמות שורש; עם זאת, רק מעט מחקרים דומים נערכו ברקמות עלה. זה ככל הנראה בגלל עלים מסוגלים לנוע בחופשיות בחלל, ואילו שורשים הם לעיתים קרובות קבור ותוקנו במדיום אגר מוצק.
בדו ח זה, התמקדנו על הדינמיקה ייתכן pPR1 פעילות במהלך אתי המושרה על ידי Pst_a2. בנוסף הקיבעון עדין של העלה שתוארו לעיל, חשוב בבירור להמחיש את הדינמיקה ייתכן של הסלולר אירועים כגון הפעלת המקדם יהלומים. אם ההבחנה בין תאים מציג פעילות pPR1 של יהלומים אינה חדה, ודא כי כל הרווחים המערכת באזור הסתנן מלאים לחלוטין עם המתלה פתוגן (ראה שלב 2.4). זה קריטי כאשר באמצעות שדה רחב זריחה stereomicroscopes מאז מיקרוסקופים אלה ללכוד כל הסימנים לזיהוי לאורך יהיה באותו מיקום אנכי של הדגימה. כלורופיל autofluorescence מתאי ששרדו מעל או מתחת התאים בתחום יהלומים מסכות בקלות את התאים המתים מפגין לא autofluorescence. הדבר נכון גם לסימן YFP.
התנאים עבור הדמיה בצילום מואץ צריכים להווצר בזהירות דרך מספר ראשוני ניסויים בתנאים שונים ניסיוני. פרמטרים עבור הדמיה בצילום מואץ תלויים במספר גורמים כגון מערכת מיקרוסקופיים, הצמחים הטרנסגניים וכן פתוגנים. כדי לקבל פרמטרים אלה, ניתחנו קודם זמני חשיפה שונים עבור YFP עוצמת האות ב העלה הסתנן ב 7 מדד מחירי הבתים של, אשר כמעט עולה בקנה אחד עם ההפעלה הראשונית של pPR1. חשיפה של 5 נקבע לפי הצורך עבור לכידת אותות YFP עם stereomicroscope השתמשו במחקר זה. מבחן דומה בוצעה הדמיה autofluorescence כלורופיל. חשיפה של הדגימה לאור בין מרווחי זמן 3 דקות היה מתוכנת לתוכנית הדמיה בצילום מואץ כמו נורמלי שדה בהיר הדמיה עם זמן חשיפה מקסימלית. המערכת שלנו (טבלה של חומרים) אפשר לנו לקבל 2.5 דקות בנוסף YFP TXR, שדה בהיר הדמיה. אילוץ זה היה הסיבה העיקרית לבחירת מרווח זמן 3 דקות. בשלב הבא, אנחנו אישר כי מצב זה זמן לשגות לפגיעה לכאורה הדגימות הצמח, אל תגרום / חוץ רחמי קלות הקשורות במתח ההפעלה של pPR1 (איור 3ב, ג). זה הוביל להתפתחות של התוכנית השתמשו במחקר זה. לפיכך, 3-מין במרווחים של קרינה פלואורסצנטית הדמיה נחשבו מספיק עבור לכידת pPR1 dynamics במהלך Pst_a2-מתווכת אתי9.
יזם-כתב בונה, במיוחד עם הכתב פלורסנט התמזגו לשירות המודיעין, היה להיות מנוצל על ידי הרבה קבוצות, זמינים בקלות מתוך קהילת המחקר; השתמשנו הבונה בהוצאת Kubo. et al. 13. לפיכך, הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש בכל מחקר בביולוגיה צמח בדיקת רקמות עלים, אם הצמחים הטרנסגניים המתאימים זמינים. פרוטוקול פשוט וקל שלנו מספק הזדמנות גדולה עבור חוקרים להוט לנתח את הדינמיקה ייתכן של כל אירוע ביולוגי המתרחשים עלים, כגון תגובה חיסונית. . זה מתקבל על הדעת כי השיטה שלנו באמצעות הקלטת פיסות גורם הלחץ הפיזי קלה על דגימות. עם זאת, בעיה זו יכול להיות נשלט על ידי הכללת הפקדים חיוביים ושליליים המתאימים, כגון טיפולים מעושה, הניסויים (איור 3ג’). התנאים ניסיוני אפשרות נוספת לשנותם ולאחר אופטימיזציה על ידי ניתוח פקדים אלה בתנאים שונים.
בשנים האחרונות, התפתחות מהירה של כלים וטכניקות הדמיה יש מגורה האינטרס של חוקרים בהיבטים ייתכן מורכבים של אירועים ביולוגי. בניתוח הדמיה כלשהם, הרכבה ותיקון המתאים של דגימות הם בין הנושאים החשובים ביותר. השיטה פשוטה ופסיביות של הרכבה המגורים שעלים תודרנית שפותחו במחקר זה יכול להיות מיושם וממוטב לניסויים הדמיה שונים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות טכנולוגיה ומדע יפן [PRESTO117665 כדי ומסווגים, ERATOJPMJER1502 כדי N.N.] ועל ידי האגודה יפן הקידום של המדע (Grants-in-Aid עבור מחקר פעילות סטארט-אפ [22880008 כדי ומסווגים], [מדענים צעירים (B) 23780040 כדי ומסווגים]). אנו מודים Senzaki א, סוזוקי י’, י’ Sugisawa, א Betsuyaku לקבלת סיוע טכני מעולה, ג’יי פארקר למתן את הלחץ Pst_a2 , ואת Demura ט על מתן וקטור pBGYN.
Materials
| Bacto Agar | BD biosciences | 214010 | |
| Bacto Protease Peptone No. 3 | BD biosciences | 211693 | |
| Bacto Yeast Extract | BD biosciences | 212750 | |
| BM2 soil | Berger | ||
| Glycerol | nacalai tesque | 17017-35 | |
| Kanamycin sulfate | Wako | 113-00343 | |
| Leica M205FA with DFC365FX, LED_MCI and Leica EL6000 (Las X software-regulated) | Leica Microsystems | Yellow fluorescent protein (YFP) and Texas Red (TXR) filters installed | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Wako | 135-00165 | |
| Micro Slide Glass (Size: 76 mm × 26 mm, Thickness: 1.0–1.2 mm) | MATSUNAMI | S1112 | |
| Micropore Surgical Tape (1.25 cm × 9 m) | 3M | 1530-0 | |
| Needleless 1 ml plastic syringe | Terumo | SS-01T | |
| Plastic cell plug tray (cell size: 44 mm × 44mm × 44 mm) | Tanaka sangyo, Japan | htray-bk72 | Any tray with similar sized cells can be used |
| Rifampicin | nacalai tesque | 30259-81 | |
| Plastic Tape (0.2 mm thick × 19 mm wide × 10 m long) | Yamato | No0200-19-1 | Any plastic/vinyl tape with similar thickness can be used |
References
- Tsuda, K., Somssich, I. E. Transcriptional networks in plant immunity. New Phytologist. 206 (3), 932-947 (2015).
- Mine, A., Sato, M., Tsuda, K. Toward a systems understanding of plant-microbe interactions. Frontiers in Plant Science. 5, (2014).
- Murray, S. L., Thomson, C., Chini, A., Read, N. D., Loake, G. J. Characterization of a novel, defense-related Arabidopsis mutant, cir1, isolated by luciferase imaging. Molecular Plant-Microbe Interactions. 15 (6), 557-566 (2002).
- Spoel, S. H., Johnson, J. S., Dong, X. Regulation of tradeoffs between plant defenses against pathogens with different lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (47), 18842-18847 (2007).
- Asai, S., Shirasu, K. Plant cells under siege: plant immune system versus pathogen effectors. Current Opinion in Plant Biology. 28, 1-8 (2015).
- Schmelzer, E., Kruger-Lebus, S., Hahlbrock, K. Temporal and Spatial Patterns of Gene Expression around Sites of Attempted Fungal Infection in Parsley Leaves. The Plant Cell. 1 (10), 993-1001 (1989).
- Ohshima, M., Itoh, H., Matsuoka, M., Murakami, T., Ohashi, Y. Analysis of stress-induced or salicylic acid-induced expression of the pathogenesis-related 1a protein gene in transgenic tobacco. The Plant Cell. 2 (2), 95-106 (1990).
- Rushton, P. J., Reinstädler, A., Lipka, V., Lippok, B., Somssich, I. E. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. The Plant Cell. 14 (4), 749-762 (2002).
- Betsuyaku, S., et al. Salicylic Acid and Jasmonic Acid Pathways are Activated in Spatially Different Domains Around the Infection Site During Effector-Triggered Immunity in Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 59 (1), 8-16 (2018).
- Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature Reviews Genetics. 11 (8), 539-548 (2010).
- Katagiri, F., Thilmony, R. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. , (2002).
- Zeier, J., Pink, B., Mueller, M. J., Berger, S. Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions: uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation. Planta. 219 (4), 673-683 (2004).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes & Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
