バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

1. 新規粒子生産のため播種細胞 注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。 標準的な細胞培養の技術により完全なダルベッコの継代 HEK 293 t/17 細胞の 80-90% コンフルエント 75 cm2フラスコの変更イーグル培地 (DMEM C) を含む 10% (巻/巻) ウシ胎児血清 (FBS) 10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、100 IU/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン。(その組成が同じ DMEM C として抗生物質なし) transfections を DMEM T 培地を準備します。 10 mL の予め温めておいた (37 ° C) ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) でセルを 2 回洗います。注:彼らは簡単にデタッチ HEK293T/17 細胞ケアを処理します。 上清を吸引し、37 ° C に加温 0.25% トリプシン溶液 1 mL と細胞を切り離す37 ° C、5% CO2インキュベーター 3−5 分や細胞を切り離し開始までに細胞のフラスコを配置します。注:これは通常細胞凝集につながるよう、5 分以上トリプシンで細胞を培養は避けてください。 トリプシンを無効するには、スライドおよび光学顕微鏡を数えるセルを用いた DMEM C 中小企業数セルの 4 つの mL を追加します。注:あまりにも多くの細胞をカウントすることを避けるために追加希釈手順はあらかじめ要求されるかもしれない。この希釈トリプシンの細胞の実際のセル密度を計算する際に考慮してください。 DMEM C. と 5 x 10 の5セル/mL に細胞を希釈します。 シード/ウェルの細胞液 2 mL で 6 も組織培養プレート プレートを前後移動し、優しく円運動を回避するセルを均等に分散する側に側します。注:これは重要なステップです。均等に配置された細胞細胞が井戸の中心に塊を行うようになります。ターンでは、これにより、良いトランスフェクションの効率は、新規粒子生産。 プレート一晩 (16-18 h) 37 ° C、5% CO2細胞培養孵卵器で孵化させなさい。 2. 3 プラスミド共トランスフェクション 注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。 細胞の形態や密度をチェックする倒立顕微鏡下で細胞を観察します。注:理想的には、細胞密度は 40-60% の合流の範囲にする必要があります。セルにもどちらもあることが重要です合流 (80−90% 合流) (20−30% 合流) を各ウェルにも散在も。40−60% の confluency の細胞密度は良い新規粒子生産をいたします。 プラスミド ミックス 次の表 1に示す 6 ウェル プレートの 1 つの井戸の数量各封筒の糖蛋白質のためのプラスミド ミックスを計算します。数量を乗算する場合、いくつかの井戸を株とミックスの不足を防ぐために余分な井戸があります。注:Sars-cov S とプラスミドをエンコーディング MERS コロナ ウイルス S など肯定的な制御の糖タンパク質と共にウイルスの封筒糖蛋白質 (Δenv 粒子) が無いネガティブ コントロール パーティクルの世代に空のベクター コントロールを含む小胞口内炎ウイルス (VSV) G 糖蛋白質細胞 (VSV Gpp) の非常に広い範囲に感染確実に知られています。プラスミドのリクエストも承ります。 ミックスは、微量遠心チューブにプラスミドと減少血清培 (材料の表参照) のボリュームを計算されます。 脂質ベースのトランスフェクション試薬を混ぜる(材料の表を参照) 1 つの井戸 (1:3 トランスフェクション比、乗算量に応じて) の表 2に示された数量からトランスフェクション試薬ミックスのボリュームを計算します。トランスフェクション試薬ミックスの不足を防ぐために余分な井戸があります。 ミックス計算脂質ベースのトランスフェクション試薬 (3 μ L/ウェル) と微量遠心チューブに減らされた血清培 (47 μ L/ウェル) のボリューム減少血清培養液およびない他の方法にトランスフェクション試薬を追加することを確かめる周り。 両方のミックスを孵化させなさい (1 つの井戸のため: 50 μ L プラスミドのミックスとミックス、脂質ベースのトランスフェクション試薬を 50 μ l 添加) 室温で 5 分間個別に。 トランスフェクション試薬ミックスの内容を 1:1 の比率でプラスミドのミックスに追加 (よく 1: 各ミックスの 50 μ L) 結果ミックスの徹底した上下ピペッティングを実行します。 室温で少なくとも 20 分のミックスを孵化させなさい。 セルの使用済み培地を吸引します。 予め温めておいた (37 ° C) 低血清培ウェルあたりのゆっくり 1 mL を追加します。 滴状 100 μ L の各ウェルにトランスフェクション ミックス。注:彼らは簡単に切り離すと HEK 293 t の井戸にトランスフェクション ミックスを追加するときは注意が必要です。 37 ° C、5% CO2セル文化振興 4-6 時間のセルを孵化させなさい。 抗生物質が含まれていない、予め温めておいた (37 ° C) DMEM T 中の井戸あたり 1 mL を追加します。注:これは重要なステップです。トランスフェクション試薬はセル透磁率を増加し、抗生物質に感受性を高めます。良いトランスフェクション効率および新規粒子生産を確保するため、抗生物質を含む細胞培養液を使用しないようにすることが重要です。 37 ° C、5% CO2セル文化 48 h のインキュベーター内のセルを孵化させなさい。 3. 新規粒子の捕集 注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。 細胞の形態や全身状態をチェックするため倒立顕微鏡下で細胞を観察します。また光をする必要があります中の色のチェック ピンク/わずかにオレンジ色。注:これは重要なステップです。これ、通常感染の新規粒子で利回りが低いに関連付けられます、トランスフェクションに関連付けられているあまりにも多くの細胞死や中の色はオレンジ/黄色 (酸性 pH) になっている場合、 50 mL コニカル遠沈管に transfected セルの培養上清を転送します。 290 x g細胞の残骸を削除する 7 分間でチューブを遠心します。 滅菌の 0.45 μ m 孔サイズのフィルターを通して明らかにした培養上清をフィルターします。 少量の因数を作る (例えば.、 500 μ L または 1 mL) クリオバイアルの新規ウイルス ソリューションの。 -80 ° C でストア注:プロトコルはここで一時停止することができます。新規粒子が何ヶ月も-80 ° C で安定しているが、解凍後、彼らは感染性を失うと再凍結を避ける 4. 新規粒子感染感受性細胞の 注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。 24 ウェル プレートで感受性細胞の細胞播種 スタンダードセル文化技術 80−90% コンフルエント 75 cm2フラスコ感受性細胞の投稿を取得: SARS コロナ ウイルスの Vero E6 セル新規粒子 (SARS Spp) と許 7 セル MERS コロナ ウイルス S の新規粒子 (MERS Spp)。注:生産されている新規の粒子が感染かどうかを確認するには、pseudovirion 感染の試金の適切な感受性細胞ラインを慎重に選択することが重要です。寛容な悪い細胞を用いた、低感染に します。 予め温めておいた (37 ° C) の DPBS 10 mL で 2 回細胞を洗浄します。 上清を吸引し、37 ° C に加温 0.25% トリプシン溶液 1 mL と細胞を切り離す37 ° C、5% CO2インキュベーター 3−5 分や細胞を切り離し開始までに細胞のフラスコを配置します。注:これは通常細胞凝集につながると 5 分以上インキュベート トリプシンで細胞を避けてください。ハァッ 7 セルはこの効果に特に敏感です。 スライドおよび光学顕微鏡を数えるセルを用いた DMEM C 中小企業数のセルを追加してトリプシンを無効します。 DMEM C. と 5 x 10 の5セル/mL に細胞を希釈します。 24 ウェルの種子井戸プレートのウェルあたりセル溶液 0.5 mL をゆっくりでプレートを前後移動や円運動を回避するセルを均等に分散する側に側注:これは重要なステップです。均等に配置された細胞細胞が井戸の中心に塊を行うようになります。ターンでは、これは良い感染性アッセイが保証されます。各新規粒子 (SARS Spp、MERS Spp) と条件は、3 つの実験的複製の 3 つの井戸を準備します。非感染 (N.I.)、空のベクター Δenv 粒子および VSV Gpp のような肯定的な制御粒子の井戸があります。 プレート一晩 (16−18 h) 37 ° C、5% CO2セル文化インキュベーターで孵化させなさい 新規パーティクルの感染症 光学顕微鏡による細胞観察し、細胞の合流のカーペットがあることを視覚的に確認します。 氷の上の解凍が新規ウイルスのクリオバイアルをもたらします。 3 回 0.5 mL (37 ° C) DPBS で加温でセルを洗浄します。注:これは重要なステップです。適切にされていない細胞洗浄通常貧しい感染読み出しにつながる感染する前に 細胞の培養上清を吸引します。 解凍新規粒子溶液 200 μ L で細胞を接種します。 37 ° C、5% CO2セル文化 1−2 h のインキュベーター内のセルを孵化させなさい。 予め温めておいた (37 ° C) の C DMEM 培地 300 μ L を追加します。 37 ° C、5% CO2セル文化 72 h のインキュベーター内のセルを孵化させなさい。 5 ルシフェラーゼ アッセイ読み出しによる感染性の定量化 注:バイオ セーフティ キャビネットの最初の手順を実行します。 雪解けルシフェリン基板 (-80 ° C で保存) と 5 x ルシフェラーゼ アッセイの換散バッファー (-20 ° C で保存) まで部屋の温度に到達します。 滅菌水で 1 x にルシフェラーゼ アッセイ換散バッファーで希釈します。 新規粒子感染細胞の培養上清を吸引します。 各ウェルに 100 μ L の 1 x ルシフェラーゼ アッセイ換散バッファーを追加します。 ロッカーのプレートを置き、ロッキング (この時点からバイオ セーフティ キャビネットの外プレートを処理できます) 室温で 15 分間インキュベートします。 各チューブの基質ルシフェリンの 20 μ L を追加することによって、各ウェルのマイクロ遠心チューブ用を準備します。 ルミノを入れます。 溶解液の 10 μ L をルシフェリン基板の 20 μ L を含む 1 つのチューブに移すことによって一度にうまく 1 つルシフェラーゼ活性測定を実行します。 ミックス内容しますが、管の壁に液体の変位を避けるために優しくはじきます。 デバイスで、チューブを置き、蓋を閉じます。 ルミノを使用して管の発光値を測定します。 相対光ユニットの測定を記録します。 5.8-5.12 の手順を繰り返してすべての井戸を分析します。注:ルミノを読んでプレートなど適切な装備では、このプロセスを自動的に実行できます。アッセイは、プレート形式 (例えば、 96 ウェル プレート形式) に調整する必要があります。 6. データの分析 計算および相対的なルシフェラーゼ ユニットの平均値と標準偏差をプロット ルシフェラーゼ アッセイの測定の平均値し、実験と生物の標準偏差の複製を計算するのにソフトウェアをプロット グラフを使用します。 標準偏差バー グラフとしてデータをプロットします。注:データの統計解析を実行すると、データ セットの少なくとも 3 つの生物学的複製を確認します。