JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

إنتاج جسيمات بسيودوتيبيد لدراسة كورونافيروس شديد العدوى في إعداد 2 مستوى السلامة الأحيائية

Published: March 01, 2019
doi:
10.3791/59010
, , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine,Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences,Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center,University of Massachusetts Medical School

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتوليد جسيمات بسيودوتيبيد في إعداد BSL-2 إدماج البروتين سبايك من الفيروسات المسببة للأمراض شديدة الالتهاب الرئوي في الشرق الأوسط وكورونافيروس المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة. هذه الجسيمات بسيودوتيبيد تحتوي على جينات مراسل لوسيفراس السماح للتحديد الكمي لدخول الفيروس إلى الخلايا المضيفة المستهدفة.

Abstract

البروتوكول يهدف إلى توليد الفيروس التاجي (CoV) سبايك (S) الانصهار البروتين جزيئات بسيودوتيبيد مع لوكيميا مورين فيروس (ملف) الأساسية ولوسيفراس مراسل، استخدام إجراء تعداء بسيطة من HEK-293T متاحة على نطاق واسع الخلية خط. بمجرد تشكيلها، وأطلق سراحهم من الخلايا المنتجة، تتضمن هذه بسيودوفيريونس جينات مراسل لوسيفراس. إلا أنها تحتوي على الفيروس التاجي مغايرة سبايك بروتين على سطحها، والجسيمات تتصرف مثل نظيراتها الأصلية الفيروس التاجي المسبّب لإدخال خطوات. على هذا النحو، وهم الأمهات البديلات ممتازة من فيريونس الأصلية لدراسة الفيروسات دخول الخلايا المضيفة. عند دخول ناجح والعدوى إلى خلايا الهدف، المراسل لوسيفراس يحصل دمج جينوم الخلية المضيفة، ويعبر عنه. استخدام الإنزيم لوسيفراس بسيطة، ترانسدوسيد الخلايا يمكن بسهولة قياسها كمياً. ميزة هامة من هذا الإجراء أنه يمكن أداؤها في مجال السلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2) مرافق بدلاً من مرافق BSL-3 مطلوب للعمل مع كورونافيروس شديدة العدوى مثل الفيروس التاجي المسبّب لمرض الالتهاب الرئوي الشرق الأوسط (أسعار الصرف السوقية-CoV) و الفيروس التاجي المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (السارس–CoV). وثمة استحقاق آخر يأتي من متعددة الاستعمالات كما أنه يمكن تطبيقها على بروتينات المغلف ينتمون إلى كافة الفئات الثلاث من البروتينات الفيروسية الانصهار، مثل الفئة أنا إنفلونزا هيماغلوتينين (هكتار) وفيروس إيبولا فيروس بروتين سكري (GP)، الفيروس الغابات “سيمليكى الثاني” فئة E1 البروتين أو بروتين سكري ز فيروس التهاب الفم الحويصلي الثالث فئة. حد المنهجية أن فإنه يمكن فقط الخص الخطوات دخول الفيروس بالبروتين المغلف ويجري التحقيق في وساطة. لدراسة الخطوات دورة الحياة الفيروسية الأخرى، أساليب أخرى مطلوبة. أمثلة للعديد من التطبيقات التي يمكن أن تستخدم هذه الجسيمات بسيودوتيبي في التحقيق في قابلية الخلية المضيفة وانتحاء واختبار تأثيرات مثبطات دخول الفيروس تشريح ومسارات دخول الفيروسية المستخدمة.

Introduction

ويشكل دخول الخلية المضيفة الخطوات الأولى من دورة الحياة الفيروسية المعدية. للفيروسات المغلفة، وهذا ينطوي على ملزمة لمستقبلات خلية مضيف واحد أو عدة مستقبلات، تليها الانصهار الأغشية الخلوية والفيروسية. تنفذ هذه المهام الأساسية المغلف الفيروسي جليكوبروتينس1،2. بروتين سكري المغلف الفيروس التاجي يسمى البروتين سبايك (S)، وهو عضو الفئة أنا الفيروسية الانصهار البروتينات2،3،4،،من56. دراسة glycoproteins المغلف الفيروسي أمر بالغ الأهمية لفهم العديد من الخصائص الهامة لفيروس معين، مثل: الشروع في دورة حياة، به المضيف وانتحاء الخلوية، فيما نقل، المرضية الفيروسية،، فضلا عن المضيف خلية الإدخال المسارات. جسيمات بسيودوتيبيد الفيروسية، أيضا باسم بسيودوفيريونس، هي أدوات قوية التي تمكننا من دراسة وظيفة البروتينات الفيروسية الانصهار بسهولة. جسيمات بسيودوتيبيد أو بسيودوفيريونس هي فيريونس تشيميريك التي تتكون من نواة الفيروسية مركب مع بروتين مغلف فيروسي مغايرة على سطحها. والغرض الرئيسي للبروتوكول لإظهار كيفية الحصول على الفيروس التاجي المسبّب لارتفاع الجسيمات بسيودوتيبيد التي تستند إلى نواة فيروس (ملف) لوكيميا مورين وتحتوي على جينات مراسل لوسيفراس. كأمثلة، يتم عرض الأسلوب لإنتاج جزيئات بسيودوتيبيد مع البروتينات سبايك العالية المسببة للمرض التنفسي الحاد الشديد (السارس) والشرق الأوسط كورونافيروس الالتهاب الرئوي (الصرف). ويصف البروتوكول تعداء الإجراء المتبع، كيف أن تصيب الهدف عرضه الخلايا، والتقدير الكمي العدوى بمقايسة لوسيفراس.

منذ خطوات الدخول بسيودوفيريونس تحكمها الفيروس التاجي S على سطحها، أنها تدخل الخلايا بطريقة مماثلة لنظيراتها الأصلية. على هذا النحو، وهم الأمهات البديلات ممتازة لفحوصات العدوى الفنية. جسيمات بسيودوتيبيد عادة مشتقة من طراز الأبوية الفيروسات مثل الفيروسات القهقرية (ملف7،،من89،10،11،،من1213 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 وفيروس نقص المناعة البشرية lentivirus – فيروس نقص المناعة البشرية23،24،25،،من2627،،من2829 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) أو رهابدوفيروسيس (فيروس التهاب الفم الحويصلي – منظمة36،39،،من4041،43،،من4244 , 45 , 46 , 47)-عند استخدامها في بسيودوتيبينج، يتم تعديل جينومات الفيروسات الأبوية لإزالة الجينات الأساسية، مما يجعلها معيبة لإنجاز دورة كاملة من النسخ متماثل. هذه الميزة تسمح لهم باستخدامها في مرافق المستوى المتوسط السلامة الأحيائية (BSL-2)، وهي ميزة هامة عبر استخدام شديد العدوى من الفيروسات الأصلية التي تتطلب أعلى من مرافق السلامة الأحيائية (BSL-3, BSL-4 التي لا تتوفر سهولة) عندما دراسات دخول الفيروس. هنا، مجموعة البروتينات S من خطر مسببات الأمراض 3 CoV السارس والصرف-CoV يتم استخدامها كأمثلة للبروتينات الفيروسية المغلف يجري إدماجها في ملف جسيمات بسيودوتيبيد، توليد بسيودوفيريونس S CoV السارس والصرف-CoV S (Spp السارس والصرف-Spp، على التوالي). هذه بسيودوفيريونس قد استخدمت بنجاح في الدراسات التي تركز على أحداث دخول هذه الفيروسات48،49،،من5051. وهناك ميزة أخرى أن الأسلوب الموصوفة هنا لا يقتصر على بروتينات الفيروس التاجي S بسيودوتيبينج: أنها مرنة جداً ويمكن استخدامها لتشمل ممثلين من جميع الفئات الثلاث من البروتينات الفيروسية الانصهار. تشمل الأمثلة هيماغلوتينين الإنفلونزا (هكتار، الفئة الأولى)52، بروتين سكري فيروس إيبولا (سباق الفئة الأولى)، E1 بروتين الفيروس الغابات سيمليكى alphavirus (SFV، الفئة الثانية)، ومنظمة بروتين سكري (ز، الفئة الثالثة)53. وبالإضافة إلى ذلك، أكثر من نوع واحد من بروتين سكري الفيروسية يمكن أن يشترك إدماجه في جسيمات بسيودوتيبيد، كما في حالة الإنفلونزا هكتار-و NA-جسيمات بسيودوتيبيد51.

وبناء على العمل الذي قام به بارتش et al.20، يصف هذا البروتوكول توليد ملف الخلية جسيمات بسيودوتيبيد مع استراتيجية ثلاثة-بلازميد المشارك تعداء 293T HEK تعداء-الكفاءة العالية ومتاحة على نطاق واسع باستخدام خط 54-بلازميد الأولى بترميز ملف الجينات الأساسية هفوة و بول ولكنها تفتقر إلى الجين env المغلف ملف. بلازميد الثاني هو وسيلة نقل ترميز اليراع لوسيفراس مراسل جينات، إشارة تغليف رنا Ψ ملف، جنبا إلى جنب مع 5 ‘–والمناطق تكرار طويلة طرفية (لاتينية) ملف 3’-المرافقة. بلازميد الثالثة ترميز البروتين الانصهار للفائدة، وفي هذه الحالة أما البروتين CoV السارس S أو S CoV السائدة. بناء تعداء المشارك من والبلازميدات الثلاثة باستخدام كاشف تعداء، الحصول على أعرب عن الجيش الملكي النيبالي والبروتينات الفيروسية داخل خلايا transfected السماح بتوليد الجسيمات بسيودوتيبيد. حيث يتم استخدام ملف كالعمود الفقري بسيودوفيريون، وهذا يحدث في غشاء البلازما: الحصول على تغليف الكشف المتضمن لمراسل الجينات لوسيفراس والتغليف إشارة إلى جزيئات الوليدة التي تتضمن أيضا سبايك الفيروس التاجي المسبّب لغشاء البلازما-وأعرب عن البروتينات. الجسيمات التي مهدها خارجاً من الخلايا يحتوي على بروتين الفيروس التاجي S على سطحها ويتم حصادها لاستخدامها في فحوصات العدوى. لأن جزيئات بسيودوتيبيد المرفأ بروتين الفيروس التاجي S وليس البروتين المغلف ملف، عند استخدامها لإصابة الخلايا، أنها تتصرف مثل نظيراتها الأصلية الفيروس التاجي المسبّب لإدخال خطوات. ثم يتم تحرير الجيش الملكي النيبالي الفيروسية التي تحتوي على المراسل لوسيفراس والمرافقة لتر داخل الخلية وتمكين أنشطة بوليميراز الفيروسات التراجعية النسخ العكسي في الحمض النووي والاندماج في جينوم الخلية المضيفة. ثم يتم التحديد الكمي للعدوى الفيروسية جسيمات بسيودوتيبيد في الخلايا المصابة مع لوسيفراس بسيطة نشاط الإنزيم. نظراً لأن تسلسل الحمض النووي الذي يحصل على إدماجها في جينوم الخلية المضيفة يحتوي فقط على الجين لوسيفراس وأي ملف أو الفيروس التاجي المسبّب للبروتين-ترميز الجينات، وهم أصلاً أكثر أماناً في الاستخدام من الفيروسات الأصلي النسخ المتماثل المختصة.

بالإضافة إلى كونه أكثر أماناً من البدائل والقدرة على التكيف للسماح بإدماج مختلف أنواع glycoproteins المغلف، الجسيمات بسيودوتيبيد الموصوفة هنا هي أيضا تنوعاً عاليا ويمكن استخدامها لدراسة جوانب كثيرة من دخول الفيروس. وهذا يشمل، لكن لا يقتصر على: اختبار قابلية الخلية المضيفة للعدوى بفيروس، تحليل مسارات الإدخال الخلوي يستخدم فيروسات المغلفة، دراسة آثار مثبطات الدوائي وعروض المخدرات، والقيام بتحييد الأجسام المضادة فحوصات، تميز المضيف إدخال خلية من الفيروسات المغلفة التي لا يمكن أن تكون مثقف، وتوليد النواقل الفيروسية لإيصال الجينات، مستقرة التعبير الخلوية للجينات للفائدة، أو إسكات الجينات.

Protocol

1-خلية البذر لإنتاج الجسيمات بسيودوتيبيد ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. بتقنيات استزراع الخلايا القياسية، الحصول قارورة2 المتلاقية 75 سم 80 – 90% من الخلايا HEK-293T/17 باساجيد في دولبيكو كاملة المتوسطة “تعديل النسر” (دميم-ج) التي تحتوي على 10% (المجلد/المجلد) المصل البقري الجنين (FBS)، 10 مم (2-هيدروكسيثيل)-1-4- حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (حبيس) والبنسلين 100 وحدة دولية/مل 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين. تعد المتوسطة تي دميم عن ترانسفيكشنز (تكوين المجلس هو نفسه دميم-C ولكن بدون المضادات الحيوية). تغسل الخلايا مع 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (دببس قبل حرارة (37 درجة مئوية) دولبيكو) مرتين.ملاحظة: التعامل مع الخلايا HEK293T/17 بعناية كما أنها فصل بسهولة. نضح المادة طافية وفصل الخلايا مع 1 مل من محلول التربسين 0.25% التي استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. ضع قارورة الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ل 3−5 دقيقة أو حتى تبدأ الخلايا فصل.ملاحظة: تجنب تفرخ الخلايا مع التربسين لأكثر من 5 دقائق كما يؤدي ذلك عادة إلى التثاقل الخلية. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 4 مل من دميم-C المتوسطة وعدد الخلايا باستخدام خلية العد الشريحة ومجهر الضوء.ملاحظة: لتجنب الاضطرار إلى عد الخلايا كثيرة جداً، يمكن خطوة إضافية تمييع المطلوبة مسبقاً. تذكر أن عاملاً في إضعاف هذا عند حساب كثافة الفعلية خلية من خلايا تريبسينيزيد. تمييع الخلايا إلى 5 × 105 خلايا/مل مع جيم دميم البذور لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا مع 2 مل من محلول الخلية الواحدة وكذلك بلطف تحريك اللوحة ذهابا وإيابا وجنبا إلى جانب لتوزيع الخلايا، وتجنب حركة دائرية بالتساوي.ملاحظة: هذا خطوة أساسية. وسيكفل الخلايا موزعة بالتساوي أن الخلايا لا تتجمع في مركز الآبار. بدوره، وهذا يضمن الكفاءة تعداء جيدة والجسيمات بسيودوتيبيد الإنتاج. احتضان لوحة بين عشية وضحاها (ح 16 – 18) في 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة. 2-3-بلازميد تعداء المشارك ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. مراقبة الخلايا تحت مجهر خفيفة مقلوب للتحقق من مورفولوجيا الخلايا والكثافة.ملاحظة: ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تكون كثافة الخلايا في النطاق كونفلوينسي 40 – 60%. من الأهمية بمكان أن الخلايا لا جداً روافد (روافد % 80−90) ولا توزع (روافد % 20−30) قليلة جداً في كل بئر. كثافة خلية 40−60% كونفلوينسي سيكفل إنتاج جزيئات بسيودوتيبيد جيدة. مزيج من البلازميدات حساب هذا المزيج بلازميد لكل بروتين سكري المغلف بعد الكميات لبئر واحدة لوحة 6-جيدا في الجدول 1. مضاعفة الكميات إذا ترانسفيكتينج آبار عديدة وتشمل بئر إضافي لتجنب نفاد ميكس.ملاحظة: جنبا إلى جنب مع السارس CoV S وق الصرف CoV ترميز والبلازميدات، تشمل ناقلات فارغة لتوليد جزيئات المراقبة السلبية التي تفتقر إلى glycoproteins المغلف الفيروسي (جسيمات Δenv) جنبا إلى جنب مع بروتين سكري مراقبة إيجابية مثل حويصلية التهاب الفم فيروس (منظمة) غ بروتين سكري معروف قوة تصيب مجموعة واسعة جداً من الخلايا (منظمة-Gpp). والبلازميدات متاحة عند الطلب. ميكس حساب أحجام والبلازميدات وانخفاض مصل الخلية الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. مزيج كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية (انظر الجدول للمواد) حساب الكميات لخليط كاشف تعداء من الكميات المبينة في الجدول 2 لبئر واحدة (1:3 نسبة تعداء، ومضاعفة كميات حسب الحاجة). وتشمل آبار إضافية لتجنب نفاد تعداء كاشف مزيج. ميكس حساب أحجام كاشف تعداء على أساس المادة الدهنية (3 ميليلتر كل بئر) وانخفاض مصل الخلية الثقافة المتوسطة (47 ميليلتر كل بئر) في أنبوب ميكروسينتريفوجي، مع التأكد من إضافة الكاشف تعداء في مستنبت الخلية المصل انخفاض وليس العكس حولها. احتضان كل خلطات (لبئر واحدة: 50 ميليلتر من البلازميدات ميكس و 50 ميليلتر من تعداء على أساس المادة الدهنية كاشف مزيج) كل على حدة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة محتويات المزيج كاشف تعداء المزيج من البلازميدات بنسبة 1:1 (ل 1 جيدا: 50 ميليلتر من كل ميكس) أداء شامل من أعلى إلى أسفل بيبيتينج من المزيج الناتج. احتضان هذا المزيج لمدة 20 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. نضح المتوسطة المستهلك من الخلايا. أضف بلطف 1 مل من المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) انخفاض مصل الخلية الثقافة المتوسطة من كل بئر. إضافة dropwise 100 ميليلتر مزيج تعداء لكل بئر.ملاحظة: كن حذراً عند إضافة هذا المزيج تعداء لآبار HEK-293T كما أنها فصل بسهولة. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة ح 4 – 6. أضف 1 مل كل بئر المتوسطة تي دميم المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية)، التي لا تحتوي على المضادات الحيويةملاحظة: هذا خطوة أساسية. زيادة نفاذية الخلية تعداء الكواشف وزيادة الحساسية للمضادات الحيوية. ولضمان كفاءة تعداء جيدة وإنتاج الجسيمات بسيودوتيبيد، من المهم تجنب استخدام مستنبت الخلية التي تحتوي على المضادات الحيوية احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة ح 48. 3-جمع جزيئات بسيودوتيبيد ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. مراقبة الخلايا تحت المجهر المقلوب الخفيفة للتحقق من مورفولوجيا الخلايا والحالة العامة. تحقق أيضا من لون الوسط الذي ينبغي أن يكون الضوء البرتقالي الوردي قليلاً.ملاحظة: هذا خطوة هامة. إذا كان هناك الكثير موت الخلايا المرتبطة تعداء أو لون متوسطة تحولت برتقالي/أصفر (الرقم الهيدروجيني الحمضية)، هذا سيكون عادة مقترنة بانخفاض الغلال في جزيئات بسيودوتيبيد المعدية نقل supernatants transfected الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي المخروطية 50 مل. الطرد المركزي أنابيب في 290 x ز 7 دقيقة لإزالة الحطام خلية. تصفية سوبيرناتانتس أوضح من خلال عامل تصفية ميكرومتر 0.45 عقيمة الحجم المسام. جعل مختبرين صغيرة الحجم (على سبيل المثال.، 500 ميليلتر أو 1 مل) من حل فيروس بسيودوتيبيد في كريوفيالس. مخزن في-80 درجة مئوية.ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. جسيمات بسيودوتيبيد مستقرة في-80 درجة مئوية لعدة شهور ولكن مجرد مذاب، تجنب إعادة تجميدها كما أنها سوف تفقد العدوى 4-بسيودوتيبيد الجسيمات العدوى الخلايا عرضه ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. بذر خلية من الخلايا عرضه في لوحة 24-جيدا الحصول على خلية قياسية ثقافة تقنيات 80−90% المتلاقية 75 سم2 قارورة الخلايا عرضه: فيرو-E6 الخلايا الخاصة بالسارس–CoV جزيئات بسيودوتيبيد (سارس-Spp) وهوه-7 خلايا S CoV الصرف جزيئات بسيودوتيبيد (أسعار الصرف السوقية-Spp).ملاحظة: لتأكيد ما إذا كانت الجزيئات بسيودوتيبيد التي تم إنتاجها معدية أم لا، من المهم أن تختار بعناية على خط خلية مناسبة عرضه لفحوصات العدوى بسيودوفيريون. استخدام الخلايا الدلالية سيئة تؤدي إلى العدوى المنخفضة. تغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) دببس. نضح المادة طافية وفصل الخلايا مع 1 مل من محلول التربسين 0.25% التي استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية. ضع قارورة الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ل 3−5 دقيقة أو حتى تبدأ الخلايا فصل.ملاحظة: تجنب تفرخ الخلايا مع التربسين لأكثر من 5 دقائق كما يؤدي ذلك عادة إلى التثاقل الخلية. خلايا هوة 7 حساسة بشكل خاص لهذا الغرض. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة دميم-C المتوسطة وعدد الخلايا باستخدام خلية العد الشريحة ومجهر الضوء. تمييع الخلايا إلى 5 × 105 خلايا/مل مع جيم دميم الآبار البذور 24-بئر لوحة مع 0.5 مل من محلول الخلية الواحدة وكذلك ولطف تحريك اللوحة ذهابا وإيابا وجنبا إلى جانب لتوزيعها بالتساوي الخلايا، وتجنب حركة دائريةملاحظة: هذا خطوة أساسية. وسيكفل الخلايا موزعة بالتساوي أن الخلايا لا تتجمع في مركز الآبار. وفي المقابل، سيضمن فحوصات العدوى الجيدة. لكل الجسيمات بسيودوتيبيد (Spp السارس، أسعار الصرف السوقية Spp) والشرط، بإعداد ثلاثة آبار ل replicates التجريبية الثلاثة. وتشمل الآبار غير مصابة (تحريضا) ومتجه فارغة Δenv الجزيئات والجسيمات مراقبة إيجابية مثل منظمة Gpp احتضان لوحة بين عشية وضحاها (ح 16−18) في 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة العدوى الجسيمات بسيودوتيبيد مراقبة الخلايا تحت المجهر الخفيفة وبصريا وتؤكد أن هناك سجادة المتلاقية للخلايا. جلب كريوفيالس فيروس بسيودوتيبيد لإذابة الجليد على الجليد. خلايا يغسل ثلاث مرات مع 0.5 مل استعد مسبقاً (37 درجة مئوية) دببسملاحظة: هذا خطوة أساسية. الخلايا التي لا يتم بشكل صحيح تشطف قبل الإصابة تؤدي عادة إلى قراءات العدوى الفقراء نضح سوبيرناتانتس الخلايا. تلقيح خلايا مع 200 ميليلتر من الجسيمات بسيودوتيبيد المذابة الحل. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة ح 1−2. إضافة 300 ميليلتر المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) المتوسطة دميم-ج. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية ثقافة حاضنة ح 72. 5-العدوى القياس الكمي بقراءات الإنزيم لوسيفراس ملاحظة: الخطوات الأولية في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. الركيزة لوسيفرين ذوبان الجليد (المخزنة في-80 درجة مئوية) والعاشر 5 لوسيفراس المقايسة تحلل المخزن المؤقت (المخزنة في-20 درجة مئوية) حتى أنها تصل إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع لوسيفراس المقايسة تحلل المخزن المؤقت إلى س 1 مع الماء المعقم. نضح سوبيرناتانتس الخلايا المصابة مع جزيئات بسيودوتيبيد. إضافة 100 ميليلتر لوسيفراس س 1 المقايسة تحلل المخزن المؤقت لكل بئر. وضع اللوحة على الروك واحتضان لمدة 15 دقيقة مع هزاز في درجة حرارة الغرفة (من هذه النقطة فصاعدا يمكن التعامل مع اللوحة خارج مجلس الوزراء السلامة الأحيائية). إعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي لكل بئر بإضافة 20 ميليلتر من الركازة لوسيفرين في كل أنبوبة. قم بتشغيل في لومينوميتير. إجراء قياس النشاط لوسيفراس أحد جيدا في كل مرة بنقل 10 ميليلتر من ليساتي إلى أنبوب واحد يحتوي على 20 ميليلتر من الركازة لوسيفرين. نفض الغبار الأنبوبة برفق خلط المحتويات، ولكن تجنب تشريد السائل على جدران الأنبوبة. ضع الأنبوبة في الجهاز وقم بإغلاق الغطاء. قياس قيمة التﻷلؤ للأنبوب باستخدام في لومينوميتير. سجل القياس وحدة خفيفة نسبيا. كرر الخطوات من 5.8 – 5.12 حتى يتم تحليل جميع الآبار.ملاحظة: مع المعدات المناسبة مثل لوحة القراءة لومينوميتير، ويمكن تنفيذ هذه العملية تلقائياً. سوف تحتاج المقايسة ستخفض إلى تنسيق لوحة (مثل تنسيق لوحة 96-بئر، ). 6-بيانات التحليل حساب والتآمر للوحدات لوسيفراس النسبية المتوسطات والانحرافات المعيارية استخدام الرسم بياني التآمر البرمجيات لحساب قياس الإنزيم لوسيفراس المتوسطات والانحرافات المعيارية للتجريبية والبيولوجية وإنشاء نسخ متماثلة. رسم البيانات كالتخطيط الشريطي مع الانحرافات المعيارية.ملاحظة: عند إجراء التحليلات الإحصائية على البيانات، تأكد من أن تشمل على الأقل ثلاثة البيولوجية يتطابق في مجموعات البيانات.

Representative Results

نتائج تمثيلية لفحوصات العدوى من السارس CoV S و S CoV الصرف جسيمات بسيودوتيبيد تظهر في الشكل 1. كما كان متوقعا، لكلا الشكل 1ألف و 1 باء، ز منظمة بسيودوتيبيد إيجابية مراقبة الجسيمات (منظمة-Gpp) قدم العدوى متوسط مرتفع جداً في 106 إلى7 10 وحدات لوسيفراس النسبية (رلو) مجموعة على التوالي. للسارس CoV S جزيئات بسيودوتيبيد (الشكل 1أ) العدوى عرضه فيرو-E6 الخلايا، العدوى متوسط قوي وتم قياس في حوالي 9.8 × 104 رلو. هذه القيمة تقريبا 3 أوامر من حجم أعلى من قيم قياس لعنصر التحكم غير مصابة (1.1 × 102 رلو)، أو الجسيمات Δenv (1.5 × 102 رلو)، التي قم بعدم إيواء أي glycoproteins الفيروسية المغلف على سطحها. وبالمثل، للصرف-CoV S جزيئات بسيودوتيبيد (الشكل 1ب) العدوى من الخلايا هوة-7، العدوى متوسط عالية وتم قياس في حوالي 1.0 × 106 رلو. وهذا تقريبا 4 أوامر من حجم أعلى من قيم قياس لعنصر التحكم غير مصابة (0.8 x 102 رلو)، أو الجسيمات Δenv (2.0 × 102 رلو). قد أنجز مقايسة العدوى إضافية التي السارس–Spp Spp الصرف متسلسل المخفف واستخدامها لتصيب فيرو-E6 الخلايا (الشكل 2أ). هذا التحليل يؤكد أن نشاط لوسيفراس قياس تعتمد على تركيز الجزيئات المستخدمة لتصيب الخلايا. لتأكيد دور إنزيم تحويل الأنجيوتنسين 2 (ACE2) ومستقبلات CoV السارس والصرف-CoV، dipeptidyl peptidase 4 (DPP4)، على التوالي، في التوسط للمرفق والدخول للجسيمات بسيودوتيبيد، استخدمنا سيئة المتساهلة HEK-293T الخلايا و ترانسفيكتيد لهم بالتعبير عن ACE2 أو DPP4 (الشكل 2ب). ثم استخدمت transfected الخلايا مقايسة العدوى. يبين هذا التحليل أن لدى overexpression ACE2 و DPP4، هناك ~ 4-سجل و ~ 2-سجل زيادة للعدوى Spp السارس والصرف-Spp، على التوالي، يؤكد أن استخدام مستقبلات بسيودوفيريونس شبيه بفيروسات أصلي. الأمثلة الموضحة هنا تبرهن على أهمية بما في ذلك سلبية (غير المصابين، جسيمات Δenv) فضلا عن شروط مراقبة إيجابية (منظمة-Gpp) عند إنتاج جزيئات بسيودوتيبيد. في الواقع، الجسيمات السيطرة الإيجابية Gpp منظمة تسمح لنا بتقييم ما إذا كانت دفعة معينة من الجسيمات بسيودوتيبيد كانت ناجحة في الغلة بسيودوفيريونس الوظيفية والمعدية. والنتائج المتوقعة للعدوى نموذجية من جسيمات Gpp منظمة في خلية الثدييات معظم خطوط في حدود رلو7 −10610. مشاكل مع الخلايا المنتجة HEK-293T/17 (رقم المرور عالية، القضايا مع كثافة الخلية) أو الكفاءة تعداء الفقيرة يمكن أن تؤثر على إنتاج الجسيمات بسيودوتيبيد الشاملة والعدوى. وعلاوة على ذلك، شروط الرقابة السلبية أيضا مهمة لأنها تسمح لنا بتقييم خطوط الأساس للقياسات رلو في خط خلية معينة (شرط غير مصاب) واستيعاب غير محددة من الجزيئات (الإصابة Δenv) الذي ليس بوساطة بروتين مغلف فيروسي. ومن الناحية المثالية، من المستحسن لنوع معين من الجسيمات بسيودوتيبيد مع بروتين فيروسي مغلف للفائدة، للحصول على القيم التي بضعة أوامر من حجم أعلى من قيم المراقبة السلبية، كما هو مبين في الشكل 1أ وب. ومع ذلك، إذا كان لنوع معين من خلية والإصابة بعدوى فيروس بسيودوتيبيد يعطي العدوى ضئيلة جداً (أي، إغلاق إلى عناصر سلبية مثل كما في الشكل 2ب في ظروف غير transfected N.T.) فإنه لا يعني بالضرورة أن بسيودوتيبيد إنتاج الجسيمات كانت خاطئة. أنه يمكن أن يكون ذلك خط خلية معينة تستخدم عدم أو سوء المتساهلة للإصابة. من المستحسن للتحقق من ما إذا كان نوع معين من خلية من المتوقع أن تكون عرضه للإصابة بالفيروس ويجري التحقيق. استهداف الخلايا الدلالية ضعيف ترانسفيكتينج مع plasmid(s) عن receptor(s) الفيروسية يمكن السماح بدخول الفيروسية أكثر كفاءة، والعدوى تحدث، كما هو مبين في الشكل 2ب، حيث عند تعداء مستقبلات ACE2 و DPP4 في HEK-293T الخلايا، وهناك ~ 4-و ~ 2-سجل زيادة في العدوى، على التوالي. بلازميد/الكاشف الكمية بكمف-ملفجاجبول ملف هفوة وبول ترميز بلازميد 300 نانوغرام ناقل نقل pTG-لوك مع مراسل لوسيفراس 400 نانوغرام ناقل بكدنا-السارس–S، بكدنا-الصرف-S أو فارغة 300 نانوغرام انخفاض مصل الخلية الثقافة المتوسطة إلى 50 ميليلتر الجدول 1: الكميات والبلازميدات وانخفاض مصل الخلية المتوسطة الثقافة المطلوبة لبئر واحدة للوحة 6-جيدا من الخلايا HEK-293T/17 لإنتاج الجسيمات بسيودوتيبيد ترانسفيكت. من تركيز الأعمال التحضيرية بلازميد، حساب حجم المطلوب للوصول إلى المبلغ المطلوب من بلازميد الحمض النووي. إذا كان هو transfected بئر واحدة أو أكثر مع البلازميدات نفسه، ضرب وحدات التخزين بالعدد المطلوب من الآبار ترانسفيكت، وتشمل بئر إضافي في العمليات الحسابية لتفادي نفاد المزيج في خطوات لاحقة. المبلغ الإجمالي للحمض النووي ويجري transfected 1 ميكروغرام/جيدا. والبلازميدات متاحة عند الطلب للمؤلفين. كاشف الكمية كاشف تعداء 3 ميليلتر انخفاض مصل الخلية الثقافة المتوسطة ميليلتر 47 الجدول 2: كميات كاشف تعداء وانخفاض مصل الخلية المتوسطة الثقافة المطلوبة لبئر واحدة للوحة 6-جيدا من الخلايا HEK-293T/17 لإنتاج الجسيمات بسيودوتيبيد ترانسفيكت. ضرب وحدات التخزين بالعدد المطلوب من الآبار ترانسفيكت وتشمل آبار إضافية في العمليات الحسابية لتفادي نفاد المزيج في خطوات لاحقة. الكاشف تعداء: نسبة الحمض النووي بلازميد المستخدمة هي 3:1. الشكل 1 : الفيروس التاجي S بسيودوتيبيد فحوصات العدوى الجسيمات في الخلايا المضيفة عرضه باستخدام جينات مراسل لوكيميا مورين العمود الفقري ولوسيفراس فيروس (ملف)- (أ) الجسيمات بسيودوتيبيد S CoV السارس العدوى الإنزيم في الخلايا فيرو-E6. (ب) S CoV الصرف الجسيمات بسيودوتيبيد العدوى الإنزيم في الخلايا هوة-7. على حد سواء (A) و (ب)، البيانات المرسومة يتوافق مع وحدات لوسيفراس النسبية المتوسط من ثلاث تجارب مستقلة، مع أشرطة الخطأ المقابلة للانحراف المعياري (التنمية المستدامة). رسم البيانات في سجل10 مقياس على المحور ص. تحريضا: عنصر تحكم غير المصابين؛ Δenv: العدوى مع جزيئات بسيودوتيبيد تفتقر إلى المغلف الفيروسي glycoproteins ومنظمة Gpp: العدوى مع جزيئات بسيودوتيبيد إذ تضع مراقبة إيجابية منظمة غ بروتين سكري المغلف. اختصار الأخرى المستخدمة، Spp السارس: الإصابة بالسارس–CoV S بسيودوتيبيد الجسيمات، أسعار الصرف السوقية Spp: العدوى مع S CoV الصرف الجسيمات بسيودوتيبيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : تركيز الاعتماد على العدوى CoV S-بسيودوفيريون ودور مستقبلات ACE2 و DPP4 في دخول السارس Spp والصرف-Spp. (أ) تركيز الاعتماد من العدوى Spp السارس والصرف-Spp تقاس لوسيفراس بنشاط الإنزيم. بسيودوفيريونس متسلسل المخفف واستخدامها لتصيب خلايا فيرو-E6. (ب) العدوى transfected المقايسة Spp السارس و Spp السائدة في الخلايا الهدف HEK 293T سيئة متساهلة إلى ACE2 الصريحة، ومستقبلات DPP4، على التوالي. رسم البيانات في سجل10 مقياس على المحور y كما في الشكل 1 من التجارب المكررة، مع أشرطة الخطأ المقابلة للانحراف المعياري (التنمية المستدامة). N.T.: الخلايا التحكم غير ترانسفيكتيد HEK-293T؛ ACE2: انجيوتنسين تحويل إنزيم 2 (مستقبلات السارس CoV) و DPP4: dipeptidyl peptidase 4 (مستقبلات CoV الصرف). الاختصارات الأخرى المستخدمة هي نفسها كما في الشكل 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف هذا البروتوكول أسلوب كفاءة إنتاج جزيئات بسيودوتيبيد تحمل البروتين S من خطر المجموعة 3 كورونافيروس، CoV السارس والصرف-CoV، في أجواء BSL-2. هذه الجسيمات، التي تتضمن جينات مراسل لوسيفراس، تمكننا من قياس الفيروس التاجي المسبّب لإحداث الإدخال بوساطة S بسهولة لوسيفراس بسيطة نسبيا مقايسة48،49،،من5051. في فحوصات العدوى باستخدام الخلايا الدلالية، نؤكد أن النشاط لوسيفراس قياس تعتمد على تركيز الجسيمات. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح تعداء مستقبلات ACE2 و DPP4 لدخول أكثر كفاءة في خطوط الخلايا الدلالية سيئة، مثل الخلايا HEK-293T. الأسلوب هو القدرة على التكيف لغيرها glycoproteins المغلف الفيروسي، وقد استخدمت على نطاق واسع48،،من4950،،من5152،53، 55،56،57،،من5859، غالباً لتكملة فحوصات أخرى مثل التحاليل البيوكيميائية أو العدوى بالفيروس الأصلي.

ويستند البروتوكول يصف لنا هنا لفي ملف يتضمن مراسل لوسيفراس. ومع ذلك، من المهم التأكيد على أن هناك مجموعة واسعة جداً من نظم بسيودوتيبينج الأخرى التي طورت بنجاح للفيروس التاجي المسبّب للتغليف S12،13،،من2526، 30 , 31 , 32 والأخرى المغلف الفيروسي جليكوبروتينس10،11،14،16،17،،من2324، 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46-تستند بعض هذه النظم الأخرى استخداماً ملف الأساسية للفيروس7،،من89،10،11،12،13 17،16،15،14، ،19،،من1820، أو استناداً إلى فيروس نقص المناعة البشرية-1 لينتيفيرال تستخدم على نطاق واسع نظام بسيودوتيبينج باستخدام استراتيجيات مختلفة23،24،25،،من2627،،من2829،30 ،31،،من3233،،من3435، أو بفيروس التهاب الفم الحويصلي rhabdovirus (منظمة) الأساسية، والذي يسمح لدمج مجموعة متنوعة glycoproteins المغلف، ومرة أخرى مع مختلف الاستراتيجيات المستخدمة37،،من3839،،من4041،42،43 ،،من4445،،من4647. وباﻹضافة إلى ذلك، مثل التجارة والنقل11،13 وطلب تقديم العروض36أو الإنزيمات خلاف لوسيفراس مثل β-جالاكتوسيداسي،من1617 الصحفيين الأخرى مثل البروتينات الفلورية ويفرز الفوسفاتيز القلوية (السكرتارية)42 وقد استخدمت بنجاح للقياسات. وعلاوة على ذلك، في الفحص الواردة في هذا البروتوكول، استخدمت من تعداء عابرة التعبير عن ملف وق CoV الجينات والبروتينات. ومع ذلك، هناك استراتيجيات أخرى للتعبير، مثل توليد خطوط الخلايا مستقرة لإنتاج فيروسات بسيودوتيبيد7،14. كل من هذه الأنظمة لديها مزايا وعيوب، من المهم النظر في المعالم الهامة التالية عند البت في أفضل نظام بسيودوتيبينج الذي يناسب احتياجات للمحقق: بسيودوفيريون الأساسية (ملف، فيروس نقص المناعة البشرية-1، أو منظمة، أو غيرها)، كيف نواة بسيودوتيبينج خاصة انتقائية في إدماج بروتين سكري مغلف فيروسي محددة، ومراسل لقراءات المقايسة (التجارة والنقل، ولوسيفراس، والسكرتارية أو غيرها)، واستراتيجية تعداء (عدد والبلازميدات المتورطين في تعداء المشارك، عابرة تعداء أو جيل من خطوط الخلايا مستقرة).

وهناك عدد من الخطوات الحاسمة في الأسلوب أن من الأهمية بمكان التأكيد. وتبلغ الكثافة الخلية، لا سيما من خط الخلية المنتجة HEK-293T/17 عاملاً حاسما في ضمان نجاح تعداء. تم العثور على كثافة خلايا في النطاق من 40 – 60% كونفلوينسي الأمثل. عادة ما ينتج كثافة أعلى تعداء منخفضة الكفاءة والإنتاج المنخفض من الجسيمات. أيضا، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الخلايا HEK-293T/17 ملتصقة أقل من خطوط الخلايا الأخرى. وينبغي توخي الحذر عند التعامل معها لتجنب فصل لهم دون داع. خيار واحد التعامل مع الخلية الثقافة الأسطح البلاستيكية مع بولي-د-يسين تعزيز الالتزام. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما يؤدي أعلى الخلية مرور معدلات تعداء الفقيرة. بعد إضافة الكاشف تعداء الخلايا HEK-293T/17، من المهم أيضا أن نتذكر أن يزيد من نفاذية الخلية. وهذا السبب في هذه النقطة فمن الأفضل تجنب استخدام المضادات الحيوية التي تحتوي على المتوسط كما أنها قد تزيد من سيتوتوكسيسيتي. قبل جمع جزيئات بسيودوتيبيد، تحقق من لون transfected supernatants خلية HEK-293T/17. عادة، بعد 48 ساعة تعداء، يأخذ لون مستنبت الخلية مسحه الوردي البرتقالي. المتوسطة اللون الأصفر عادة يترجم إلى جسيمات بسيودوتيبيد ضعف غلة وهو غالباً نتيجة للقضايا مع الخلية البذر الكثافة أو رقم المرور عالية.

في هذا البروتوكول، ويتم إنتاج الجسيمات بسيودوتيبيد في شكل لوحة 6-جيدا. لزيادة حجم الجسيمات المنتجة، يمكن ترانسفيكتيد عدة آبار للوحة 6-جيدا مع نفس المزيج والبلازميدات ويمكن تجميع في supernatants. ثم يمكن التجمع الموضحة، والتي تمت تصفيتها والكوتيد. وبدلاً من ذلك، لتوسيع نطاق إنتاج أعلى، أنواع أخرى من السفن التي يمكن استخدامها (مثلاً 25 أو قوارير2 75 سم). وفي هذه الحالة، شروط تعداء ينبغي الارتقاء تبعاً لذلك. في هذا البروتوكول، تتم مقايسة العدوى باستخدام تنسيق لوحة 24-جيدا ولومينوميتير فقط يسمح قياسات أنبوب واحد في كل مرة. لعروض عالية الإنتاجية، أيضا تنسيقات أخرى ممكنة، مثل تنسيق لوحة 96-جيدا ولومينوميتير قارئ لوحة. وحدات التخزين والمواد الكاشفة للانزيم لوسيفراس بحاجة إلى تكييف وفقا لذلك. تخزين الجسيمات بسيودوتيبيد في كريوفيالس في-80 درجة مئوية يحافظ على استقرارها لعدة أشهر دون انخفاض ملحوظ في العدوى. من المستحسن عدم إخضاعها تجميد أذاب دورات كهذه ستنخفض العدوى على مر الزمن. وهكذا، فمن الأفضل أن تقوم بتخزينها في مختبرين الصغيرة مثل 0.5-1 مل وذوبان الجليد لهم قبل عدوى.

الطريقة المعروضة هنا نقائص عديدة. مهم هو أن جزيئات بسيودوتيبيد الخص أحداث الإدخال فقط الفيروسية. لتحليل الخطوات الأخرى في دورة حياة المعدية، فحوصات أخرى مطلوبة. وعلاوة على ذلك، كملف برعم الجسيمات في غشاء البلازما، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن بروتين سكري المغلف وتجري دراسة الاحتياجات للحركة أيضا إلى غشاء البلازما لإدماجها في بسيودوفيريونس أثناء عملية الإنتاج. على هذا النحو، فإنه من المهم أن نعرف فيها في الخلية بروتين سكري مغلف فيروسي خاصة يعبر عن ظروف تعداء، مثل بتصور التعريب سوبسيلولار مع مقايسة الفلورة، و/أو التحقق من وجود إشارات الاحتفاظ داخل البروتين. أيضا، بينما البروتوكول توضح الخطوات لإنتاج واختبار العدوى، فهي لا تفصيل كيفية قياس إدماج glycoproteins المغلف الفيروسي في جزيئات بسيودوتيبيد. أسلوب واحد لإجراء فحوصات لطخة غربية على حلول تركز الجزيئات، كما هو موضح سابقا50،51 لإدماج S CoV السائدة. في هذه الاختبارات، سبر بروتين سكري المغلف S من الصرف-CoV جنبا إلى جنب مع البروتين قفيصه (p30) من ملف، مما يسمح لنا بتطبيع إدماج جزيئات من البروتين S. أمثلة أخرى على مثل هذه الاختبارات تحليل إدماج بروتين سكري المغلف الفيروسي في بسيودوفيريونس قد أجريت لإدماج S CoV السارس في فيروس نقص المناعة البشرية-1 بسيودوفيريون لينتيفيرال نظام32 ، فيروس إيبولا بروتين سكري (GP) في ملف آخر بسيودوتيبيد نظام الجسيمات17، والإنفلونزا هيماغلوتينين (هكتار) والنورامينيداز (غ) في منظمة بسيودوفيريونس38. هو تطور حديث في وصف الجسيمات بسيودوتيبيد الإنتاج باستخدام أجهزة التصوير المبتكرة مثل نانوسيت: أنها تمكننا من تصور مباشرة وقياسها كمياً، وحجم الجسيمات الفيروسية50. الجهاز يوفر معلومات مفصلة عن إنتاج الجسيمات عموما؛ ومع ذلك، المهم أن نضع في اعتبارنا أن لا تقدم معلومات على إدماج بروتين سكري المغلف. اتجاه مستقبل لتطبيق هذه الجسيمات بسيودوفيريون تنوعاً لتحليل أحداث الانصهار الفيروسية الفردية باستخدام الجسيمات واحدة تتبع وميكروفلويديكس والإنعكاس الداخلي الكلي fluorescence مجهرية60،61 ،62. تم بنجاح تطبيق هذه النهج لفيروس الإنفلونزا وجزيئات الفيروس التاجي الماكر، فضلا عن الإنفلونزا هكتار-و NA-بسيودوتيبيد بسيودوفيريونس المستندة إلى منظمة63. ويجري حاليا نشر هذه التقنيات المطبقة للفيروس التاجي المسبّب للجسيمات S بسيودوتيبيد المستندة إلى ملف.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبرات ويتاكر ودانيال التعليقات المفيدة. تمويل البحوث وقدمت في المعاهد الوطنية للصحة منح R21 AI111085 و R01 AI135270. T.T. تسلم الدعم من “الزمالة علوم الحياة الرئاسية” في جامعة كورنيل والعلوم مؤسسة الدراسات العليا بحوث الزمالات البرنامج الوطني تحت “رقم المنحة” DGE-1650441. L.N. وتسلم الدعم من صموئيل جيم فليمينغ الأسرة زمالة الدراسات العليا والعلوم مؤسسة الدراسات العليا البحوث الزمالة البرنامج الوطني تحت “رقم المنحة” DGE-1650441. ويدعم هذا العمل أيضا 1504846 مؤسسة العلوم الوطنية (للتنمية المستدامة و G.R.W.).

Materials

Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77 (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4 (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202, 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300 (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261 (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326 (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78 (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75 (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78 (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55 (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88 (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -. C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225 (2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393 (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321 (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166 (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305 (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87 (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85 (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84 (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206 (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446 (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436 (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161 (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59 (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84 (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88 (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10 (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34 (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169 (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5 (12), 126 (2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88 (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6 (23), 2035 (2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2′ region. Journal of General Virology. , (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83 (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393 (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -. Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34 (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -. Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29 (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -. L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537 (2016).

Tags

Pseudotyped ParticlesCoronavirusViral EntryBiosafety Level 2HEK293T CellsTransfectionPlasmid CotransfectionCell CultureCell DensityCell Morphology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image