JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Bir biyogüvenlik seviye 2 ortamda yüksek patojenik Coronaviruses çalışmaya Pseudotyped parçacıklar imalatı

Published: March 01, 2019
doi:
10.3791/59010
, , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine,Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences,Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center,University of Massachusetts Medical School

Summary

Burada, pseudotyped parçacıklar spike protein yüksek patojenik virüs Ortadoğu solunum sendromu ve şiddetli akut solunum Sendromu coronaviruses birleştiren bir BSL-2 ayar oluşturmak için bir protokol mevcut. Pseudotyped bu parçacıklar hedef ana bilgisayar hücreler virüs girdiği miktar izin luciferase muhabir gen içerir.

Abstract

Protokol amaçlamaktadır coronavirus (CoV) Başak (S) füzyon proteini oluşturmak için yaygın olarak kullanılan HEK-293T, basit transfection yordamı kullanarak fare lösemi virüs (MLV) çekirdek ve luciferase muhabir, pseudotyped parçacıkları hücre satırı. Bir kez oluşan ve yapımcı hücrelerden serbest bırakmak, bu pseudovirions bir luciferase muhabir gen dahil. Yalnızca içerdikleri beri onların yüzeyinde protein Contegra coronavirus spike, parçacıklar giriş adımlar için yerel coronavirus karşılıkları gibi davranırlar. Bu nedenle, onlar konak hücreleri viral girdiği eğitim için yerel virions mükemmel vekilleri vardır. Başarılı girmek ve enfeksiyon hedef hücreleri içine, luciferase muhabir konak hücre genomu entegre ve ifade edilir. Basit luciferase tahlil kullanarak, transduced hücreleri kolayca sayısal. Biyogüvenlik içinde gerçekleştirilebilir yordam önemli bir avantaj olduğunu 2 (BSL-2) özellikleri yerine BSL-3 imkanları ile Orta Doğu solunum Sendromu coronavirus (MERS-CoV) gibi yüksek patojenik coronaviruses çalışmaları için gerekli düzey ve Şiddetli akut solunum Sendromu coronavirus (SARS-CoV). Ait tüm üç sınıf sınıfı gibi viral füzyon protein için ben grip hemagglutinin (HA) ve Ebola virüsü glikoprotein (GP), sınıf II Semliki orman virüs E1 zarf proteinleri uygulanabilir olarak başka bir yararı çok yönlülüğünü gelir protein, ya da sınıf III vesicular Stomatit virüs G glikoprotein. Bir metodoloji sadece virüs giriş adımları soruşturuluyor zarf protein tarafından aracılı özetlemek kısıtlamasıdır. Diğer viral ömrünün adımları eğitimi için diğer yöntemleri gereklidir. Bu pseudotype parçacıklar-ebilmek var olmak kullanılmış içinde birçok uygulama örnekleri soruşturma konak hücre duyarlılık ve tropism ve kullanılan viral giriş yolları incelemek için virüs giriş inhibitörlerinin etkileri test içerir.

Introduction

Konak Hücre girişini bulaşıcı viral ömrünün ilk adımlar oluşturmaktadır. Saran virüs, bu bağlama için bir tek ana bilgisayar hücre reseptör veya birkaç reseptörleri, viral ve hücresel zarları füzyon tarafından takip içerir. Bu temel işlevler viral zarf glikoproteinlerin1,2tarafından yapılmaktadır. Coronavirus zarf glikoprotein spike (S) protein denir ve sınıf üyesi olan viral ben füzyon protein2,3,4,5,6. Viral zarf glikoproteinlerin eğitim çok önemli özellikleri belirli bir virüs gibi anlamak için kritik: yaşam döngüsü başlatma, kendi ev sahibi ve hücresel tropism, türler arası iletim, viral Patogenez yanı sıra ana hücre giriş yollar. Adı da pseudovirions, viral pseudotyped parçacıklar bize kolayca viral füzyon proteinlerin işlevi incelemek izin güçlü araçlardır. Pseudotyped partikülleri veya pseudovirions bir vekil viral çekirdek Contegra viral zarf protein onların yüzeyde oluşan chimeric virions vardır. Protokolün temel amacı elde etme göstermektir coronavirus spike bir fare lösemi virüs (MLV) çekirdeğini temel alır ve bir luciferase muhabir gen içeren pseudotyped parçacıklar. Örnek olarak, spike proteinler yüksek patojenik şiddetli akut solunum Sendromu (SARS) ve Orta Doğu solunum Sendromu (MERS) coronaviruses ile pseudotyped parçacıklar üretmek için yöntem sunulmaktadır. Protokol transfection yordam hücreleri duyarlı hedef bulaştırmak için nasıl, yer ve infektivite miktar luciferase tahlil tarafından açıklanır.

Pseudovirions giriş adımlardan onların yüzeyde coronavirus S tarafından yönetilir beri onlar yerel meslektaşları benzer şekilde hücre girin. Bu nedenle, onlar fonksiyonel infektivite deneyleri mükemmel vekilleri vardır. Pseudotyped parçacıklar genellikle ebeveyn modeli virüs Retrovirüsler (MLV7,8,9,10,11,12,13 gibi türetilir , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 ve lentivirus insan immün yetmezlik virüsü — HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) veya rhabdoviruses (vesicular Stomatit virüs — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). pseudotyping içinde kullanıldığında, ebeveyn virüslerin genleri gerekli genler, onları tam çoğaltma döngüsü gerçekleştirmek için arızalı işleme kaldırmak için değiştirilir. Bu özellik onları (BSL-2) ara biyogüvenlik düzeyi tesislerinde kullanılmak üzere sağlar ve daha yüksek Biyogüvenlik İmkanları (BSL-3, BSL-4 olarak kolayca kullanılabilir değil) gerektiren yüksek patojenik yerel virüs kullanarak önemli bir avantaj olduğu zaman virüs giriş çalışmalar yürütmektedir. Burada, grup riski S proteinlerin 3 patojenler SARS-CoV ve MERS-CoV MLV dahil ediliyor viral zarf proteinleri örnekleri olarak kullanılır pseudotyped parçacıklar, SARS-CoV ve MERS-CoV leri pseudovirions üreten (SARS-Spp ve MERS-Spp, sırasıyla). Bu pseudovirions başarılı bir şekilde giriş bu virüs48,49,50,51olaylara odaklanan çalışmalarda kullanılmaktadır. Burada açıklanan tekniği pseudotyping coronavirus S proteinler için sınırlı değildir başka bir avantajdır: çok esnek ve viral füzyon protein tüm üç sınıf temsilcileri dahil etmek için kullanılabilir. Grip hemagglutinin örnekler (HA, sınıf ı)52, Ebola virüsü glikoprotein (GP sınıf ı), E1 protein alphavirus Semliki orman virüs (SFV, sınıf II) ve VSV glikoprotein (G, Sınıf III)53. Ayrıca, birden fazla tür viral glikoprotein grip gibi durumunda ortak pseudotyped bir parçacık dahil olabilir HA – ve NA – pseudotyped parçacıklar51.

Bartosch ve ark.20tarafından gerçekleştirilen çalışmalara dayanarak, bu iletişim kuralını açıklar MLV nesil pseudotyped parçacıkları yaygın olarak bulunur ve son derece transfection yetkili HEK 293T kullanarak bir üç-plazmid co transfection stratejisi ile hücre satırı 54. ilk plazmid MLV çekirdek genler gag ve pol kodlar ama MLV zarf env gen yoksun. İkinci plazmid ile birlikte 5′ bir MLV Ψ-RNA ambalaj sinyal bir ateş böceği luciferase muhabir gen kodlar bir transfer vektörü olduğu- ve 3′-kanat MLV uzun terminal tekrar (LTR) bölgeler. Üçüncü plazmid füzyon protein ilgi, bu durumda da SARS-CoV S veya MERS-CoV S protein kodlar. Ortak transfection transfection reaktif kullanarak üç Plazmidler, viral RNA ve proteinler pseudotyped parçacıklar nesil izin transfected hücrelerde ifade. MLV pseudovirion bel kemiği olarak kullanıldığından, bu plazma zarı oluşur: luciferase gen muhabir ve ambalaj sinyal içeren RNA’ların Ayrıca plazma zarı ifade coronavirus spike dahil doğmakta olan parçacıklar halinde kapsüllenmiş proteinler. Hücrelerden bud parçacıklar onların yüzeyde coronavirus S protein içerir ve kullanılmak üzere infektivite deneyleri hasat. Çünkü pseudotyped parçacıklar liman coronavirus S protein ve değil MLV zarf protein, hücreleri bulaşmasını için kullanıldığında, yerel coronavirus karşılıkları için giriş merdiven gibi davranıyorlar. Viral RNA luciferase muhabir içeren ve LTRs kanat sonra hücre içinde serbest bırakılır ve onun ters transkripsiyon DNA içine ve konak hücre genomu entegrasyonu retroviral polimeraz faaliyetleri etkinleştirin. Enfekte hücreleri pseudotyped parçacıklar viral infektivite miktar sonra basit luciferase etkinliği tahlil ile gerçekleştirilir. Luciferase gen ve MLV veya coronavirus protein kodlama genler hiçbiri sadece konak hücre genomu entegre DNA dizisi içerdiğinden, onlar doğal olarak çoğaltma yetkili yerel virüs kullanmak daha güvenli.

Daha güvenli vekilleri olmanın yanı sıra ve çeşitli zarf glikoproteinlerin birleşmesiyle izin vermek son derece uyarlanabilir, burada açıklanan pseudotyped parçacıklar da çok yönlü ve virüs giriş birçok yönlerini incelemek için kullanılır. Bu içerir ancak bunlarla sınırlı değildir: virüs enfeksiyonu konak hücre duyarlılık test, saran bir virüs kullanır hücresel giriş yolları analiz, farmakolojik inhibitörleri ve uyuşturucu gösterimleri etkileri eğitimi, nötralizasyon antikor iletken konak Hücre girişini kültürlü cant saran virüslerin karakterize ve gen teslim için viral vektörler üreten deneyleri, hücresel ifade faiz veya gen susturmak genlerin kararlı.

Protocol

1. hücre Pseudotyped parçacık üretimi için tohum Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin. Standart hücre kültürü teknikleri tarafından bir % 80 – 90 Konfluent 75 cm2 şişe tam Dulbecco pasajlı HEK-293T/17 hücre elde’nın modifiye kartal orta (DMEM-C) içeren (vol/vol) fetal sığır serum (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 100 IU/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin. DMEM-T orta (kompozisyon DMEM-C olarak ama Antibiyotikler olmadan aynıdır) transfections için hazır olun. Hücreleri 10 mL, Önceden ısıtılmış (37 ° C) Dulbecco’nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile iki kez yıkayın.Not: Onlar kolayca ayırmak gibi HEK293T/17 hücreleri itina ile başa. Süpernatant Aspire edin ve 1 mL % 0.25 tripsin çözeltisi 37 ° C’de önceden ısınmış hücrelerle ayır Hücre şişeye 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka 3−5 min için veya hücreleri ayırma başlayana yerleştirin.Not: Bu genellikle hücre topaklanma için yol açar gibi tripsin daha–dan 5 min için hücrelerle kuluçka kaçının. Tripsin 4 mL DMEM-C orta ve sayısı hücre ışık mikroskobu ve slayt sayımı bir hücre kullanarak ekleyerek devre dışı bırakın.Not: Çok fazla hücreleri saymak zorunda kalmamak için bir ek seyreltme adım önceden gerekli olabilir. Trypsinized hücreleri gerçek hücre yoğunluğu hesaplanırken bu seyreltme faktörü unutmayın. 5 x 105 hücre/mL DMEM-c ile hücrelere sulandırmak 6-iyi doku kültürü plaka hücre çözümü de başına 2 mL ile tohum ve yavaşça plaka ileri geri hareket ve hücreleri, dairesel hareketlerle kaçınarak olarak dağıtabilmenizi yan.Not: Bu önemli bir adımdır. Eşit olarak dağıtılmış hücreler hücreleri wells merkezinde yığın değil sağlayacaktır. Buna karşılık, bu iyi transfection verimliliği ve pseudotyped parçacık sağlayacaktır üretim. Plaka gecede (16-18 h) bir 37 ° C’de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka kuluçkaya. 2. üç-plazmid co transfection Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin. Hücreleri hücre morfolojisi ve yoğunluğu için kontrol etmek için bir ters ışık mikroskobu altında gözlemlemek.Not: İdeal olarak, hücre yoğunluğu % 40-60 confluency aralığında olmalıdır. Bu hücreler de çok olduğunu önemlidir birleşmesi (−90 birleşmesi) ne de çok seyrek dağıtılmış (−30 birleşmesi) her kuyuya. −60 confluency hücre yoğunluğu iyi pseudotyped parçacıklar üretim sağlayacaktır. Plazmid mix Plazmid karıştırmak için bir kuyu miktarları Tablo 1′ de gösterilen 6-şey plaka takip her zarf glikoprotein hesaplayın. Miktarları çarpma Eğer birkaç kuyu transfecting ve karışımı azalmasını önlemek için ilave bir şey dahil.Not: SARS-CoV S ve MERS-CoV plazmid kodlama S ile birlikte, boş vektör kontrolü gibi viral zarf glikoproteinlerin (Δenv parçacıklar) ile birlikte olumlu denetim glikoprotein eksikliği negatif kontrol parçacıkları oluşturulmasında içerir veziküler sağlam hücreleri (VSV-Gpp) çok geniş bir yelpazesi bulaştırmak için bilinen virüs (VSV) G glikoprotein Stomatit. Plazmid talep üzerine temin edilmektedir. Plazmid ve düşük serum hücre kültür orta ( Tablo malzemelerigörmek) hesaplanan miktarda bir microcentrifuge tüp içinde karıştırın. Transfection lipid-esaslı reaktif mix (bkz. Tablo malzemeleri) Bu birim için Tablo 2 ‘ de bir şey (1:3 transfection oranı, çarpın gerektiği gibi miktarları) gösterilen miktarları transfection reaktif karışımından hesaplayın. Transfection reaktif karışımı azalmasını önlemek için ilave kuyu bulunmaktadır. Lipid tabanlı transfection reaktifi (iyi başına 3 µL) ve düşük serum hücre kültür orta (47 µL iyi başı) transfection reaktif düşük serum hücre kültür orta ve başka bir yol eklemek emin bir microcentrifuge tüp hesaplanan miktarda karıştırın etrafında. Her iki karışımları kuluçkaya (bir şey için: mix 50 µL Plazmidler ve mix 50 µL lipid tabanlı transfection reaktif) oda sıcaklığında 5 min için ayrı ayrı. 1:1 oranında plazmid karışıma transfection reaktif mix içeriği ekleyin (1 iyi için: 50 µL her Mix) Tam yukarı-aşağı elde edilen karışımı pipetting gerçekleştirin. Karıştırmak için oda sıcaklığında en az 20 dk kuluçkaya. Hücre harcanan orta Aspire edin. Önceden ısıtılmış (37 ° C) indirimli serum hücre kültür orta iyi başına yavaşça 1 mL ekleyin. Eklemek dropwise 100 µL her şey için transfection karışımı.Not: Onlar kolayca ayırmak gibi transfection mix HEK-293T kuyu için eklerken dikkatli olun. Hücreleri bir 37 ° C’de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka için 4-6 h kuluçkaya. Antibiyotik içeren önceden ısıtılmış (37 ° C) DMEM-T orta kuyu başına 1 mL ekleyinNot: Bu önemli bir adımdır. Transfection reaktifler hücre geçirgenliği artırır ve antibiyotik duyarlılığı artırmak. İyi transfection verimlilik ve pseudotyped parçacık üretim emin olmak için hücre kültürü antibiyotik içeren orta kullanmamak önemlidir Hücreleri bir 37 ° C’de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 48 h için kuluçkaya. 3. pseudotyped parçacıklar koleksiyonu Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin. Hücreleri hücre morfolojisi ve genel durumu denetlemek için ters ışık mikroskop altında gözlemlemek. Ayrıca hafif olmalı orta renk kontrol pembe/biraz turuncu.Not: Bu önemli bir adımdır. Transfection ile ilgili çok fazla hücre ölümü veya turuncu/sarı (asidik pH) açık orta renk varsa, bu genellikle bulaşıcı pseudotyped parçacıkları daha düşük verimleri ile ilişkili olacaktır Transfected hücre supernatants 50 mL konik santrifüj tüpleri için transfer. Tüpler, 290 x g hücre artıkları kaldırmak 7 dakika santrifüj kapasitesi. Eritilmiş supernatants gözenek ölçekli steril 0,45 µm filtreden filtre. Küçük hacimli aliquots yapmak (e.g., 500 µL veya 1 mL) cryovials pseudotyped virüs çözüm. Mağaza-80 ° C’deNot: Protokol burada duraklatılmış. Pseudotyped parçacıklar aylarca-80 ° C’de sabit ama bir kez çözdürülen infektivite kaybederler gibi onları yeniden donma önlemek 4. pseudotyped parçacık enfeksiyon duyarlı hücre Not: Biyogüvenlik kabini bu adımı gerçekleştirin. 24-şey plaka duyarlı hücrelerin hücre tohumlama Standart hücre kültürü teknikleri −90 Konfluent 75 cm2 şişeye duyarlı hücre tarafından elde etmek: Vero-E6 hücreler için SARS-CoV pseudotyped parçacıklar (SARS-Spp) ve ha-7 hücreleri MERS-CoV s pseudotyped parçacıklar (MERS-Spp).Not: Üretilen pseudotyped parçacıklar bulaşıcı olup olmadığını doğrulamak için dikkatli bir şekilde pseudovirion infektivite deneyleri için uygun duyarlı hücre satır seçmek önemlidir. Kötü izin veren hücreler kullanma için düşük infektivite yol açacaktır. Hücreleri iki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) DPBS 10 mL ile yıkayın. Süpernatant Aspire edin ve 1 mL % 0.25 tripsin çözeltisi 37 ° C’de önceden ısınmış hücrelerle ayır Hücre şişeye 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka 3−5 min için veya hücreleri ayırma başlayana yerleştirin.Not: Bu genellikle hücre topaklanma için yol açar gibi 5 dakikadan fazla tripsin hücrelerle kuluçka kaçının. Ha-7 hücreleri bu yönde özellikle duyarlıdır. Tripsin DMEM-C orta ve sayısı hücreleri ışık mikroskobu ve slayt sayımı bir hücre kullanarak ekleyerek devre dışı bırakın. 5 x 105 hücre/mL DMEM-c ile hücrelere sulandırmak 24-iyi tohum kuyu hücre çözümü de başına 0.5 mL ile plaka yavaşça plaka ileri geri hareket ve hücreleri, dairesel hareketlerle kaçınarak olarak dağıtabilmenizi yanNot: Bu önemli bir adımdır. Eşit olarak dağıtılmış hücreler hücreleri wells merkezinde yığın değil sağlayacaktır. Buna karşılık, bu iyi infektivite deneyleri sağlayacaktır. Her pseudotyped parçacık (SARS-Spp, MERS-Spp) ve koşul için üç kuyular için üç deneysel çoğaltır hazırlayın. Enfekte olmayan (nı), boş vektör Δenv parçacıklar ve VSV Gpp gibi olumlu denetim parçacıkların Wells dahil Plaka gecede (16−18 s) bir 37 ° C’de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka kuluçkaya Pseudotyped parçacık enfeksiyon Hücreleri ışık mikroskop altında gözlemlemek ve görsel olarak hücre Konfluent halı olduğunu doğrulayın. Cryovials buz erimek için pseudotyped virüs getir. Yıkama hücreleri üç kez ile 0.5 mL (37 ° C) DPBS önceden ısındıNot: Bu önemli bir adımdır. Düzgün olmayan hücreler öncesinde enfeksiyon genellikle yoksul infektivite çıktıları için kurşun durulanır Hücre supernatants Aspire edin. Çözdürülen pseudotyped parçacık çözüm 200 µL hücrelerle aşılamak. Hücreleri bir 37 ° C’de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 1−2 h için kuluçkaya. Önceden ısıtılmış (37 ° c) DMEM-C orta 300 µL ekleyin. Hücreleri bir 37 ° C’de % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 72 h için kuluçkaya. 5. infektivite miktar Luciferase tahlil okuma tarafından Not: Biyogüvenlik kabini ilk adımları atmış olursunuz. Tezcan biyoluminesans substrat (-80 ° C’de depolanan) ve oda sıcaklığında ulaşmak (-20 ° C’de depolanan) 5 x luciferase tahlil lizis tampon onlar kadar. Luciferase tahlil lizis arabelleğe steril su ile 1 x oranında seyreltin. Supernatants pseudotyped parçacıkları ile enfekte hücreleri Aspire edin. 1 x luciferase tahlil lizis arabelleği 100 µL her şey için ekleyin. (Plaka dışında bir biyogüvenlik kabini ele alınabilir bu noktadan itibaren) oda sıcaklığında sallanan ile 15dk için kuluçkaya ve plaka üzerinde bir rocker yerleştirin. Microcentrifuge tüpler her tüpte biyoluminesans substrat 20 µL ekleyerek her şey için hazır olun. Luminometer üzerinde açın. Luciferase etkinlik ölçümü bir de teker teker biyoluminesans substrat 20 µL içeren bir tüp lysate, 10 µL aktararak gerçekleştirin. Yumuşak içeriğini karıştırmak, ama sıvı tüp duvarlarında yerinden önlemek için tüp fiske. Cihazda tüpü yerleştirin ve kapağını kapatın. Tüp ışıldama değerini luminometer kullanarak ölçün. Göreli ışık biriminin ölçüm kaydedin. Bütün wells analiz 5.8-5.12 tamamlayana dek.Not: Luminometer okuma bir tabak gibi uygun ekipman ile bu işlemi otomatik olarak gerçekleştirilir. Tahlil plaka biçimi (örneğin, 96-şey plaka biçimi) ölçeklendirilmesi gerekecek. 6. veri analizi Hesaplama ve çizme göreli luciferase birimlerinin ortalamaları ve standart sapmalar Bir grafik yazılımı komplo luciferase tahlil ölçüm ortalamasını alır ve standart sapmalar deneysel ve biyolojik çoğaltır hesaplamak için kullanın. Verileri standart sapmalar ile çubuk grafik olarak çizmek.Not: İstatistiksel analizler üzerinde veri işlemi sırasında veri kümelerinde en az üç biyolojik çoğaltır eklediğinizden emin olun.

Representative Results

Temsilcisi sonuçları SARS-CoV S ve MERS-CoV S infektivite deneyleri pseudotyped parçacıklar şekil 1′ de gösterilmiştir. , Her iki şekil 1A ve 1Biçin VSV G pseudotyped beklendiği gibi olumlu denetim parçacıklar (VSV-Gpp) verdi çok yüksek ortalama infektivite 10 ‘6 -107 göreli luciferase birim (RLU) aralığı anılan sıraya göre. SARS-CoV s pseudotyped parçacıklar (şekil 1A) enfeksiyon duyarlı Vero-E6 hücre güçlü bir ortalama infektivite ölçülen yönü 9,8 x 104 RLU. Bu değer neredeyse 3 büyüklük enfekte olmayan denetim için ölçülen değerleri daha yüksek olur (1.1 x 102 RLU), veya Δenv parçacıklar (1.5 x 102 RLU), hangi onların yüzeyde herhangi bir viral zarf glikoproteinlerin liman değil. Benzer şekilde, MERS-CoV S için ha-7 hücre pseudotyped parçacıklar (şekil 1B) enfeksiyon, yüksek bir ortalama infektivite ölçülen yönü 1.0 x 10 civarında6 RLU. Bu neredeyse 4 büyüklük enfekte olmayan denetim için ölçülen değerleri daha yüksek olduğunu (0.8 x 102 RLU), veya Δenv parçacıklar (2.0 x 102 RLU). Bir ek infektivite tahlil içinde SARS-Spp MERS-Spp seri olarak seyreltilmiş ve Vero-E6 hücreleri (Şekil 2A) bulaştırmak için kullanılan gerçekleştirildi. Bu tahlil ölçülen luciferase etkinliği hücre bulaştırmak için kullanılan parçacıklar konsantrasyon bağımlı olduğunu onaylar. Dipeptidyl peptidaz 4 (DPP4), SARS-CoV ve MERS-CoV, reseptörleri ve rolü anjiyotensin dönüştürme enzim 2 (ACE2) sırasıyla, ek ve giriş pseudotyped parçacıkların arabuluculuk onaylamak için izin veren kötü HEK-293T hücreleri kullanılan ve Onları ACE2 ya da DPP4 ifade etmek için transfected (Resim 2B). Transfected hücreleri sonra bir infektivite tahlil için kullanılmıştır. Bu analiz overexpression ACE2 ve DPP4 orada bir ~ 4-günlük ve ~ 2-günlük artış SARS-Spp ve MERS-Spp infektivite için sırasıyla göstermektedir bu reseptör kullanım-in pseudovirions teyit yerel virüs için benzer. Burada gösterilen örnekler de dahil olmak üzere önemini negatif (non-enfekte, Δenv parçacıklar) yanı sıra pozitif kontrol (VSV-Gpp) koşulları pseudotyped parçacıklar üretirken göstermektedir. Nitekim, olumlu denetim VSV Gpp parçacıklar pseudotyped parçacıkları belirli bir dizi fonksiyonel ve Enfektif pseudovirions verimli başarılı olup olmadığını değerlendirmek sağlamak. Tipik enfeksiyon en memeli hücre hatları 106−107 RLU aralığında olan VSV Gpp parçacıklar tarafından beklenen sonuçları. HEK-293T/17 üretici hücreler (yüksek geçit sayı, hücre yoğunluğu ile sorunları) ile ilgili sorunlar veya genel pseudotyped parçacık üretim ve infektivite zavallı transfection verimliliği etkisi. Ayrıca, negatif kontrol koşulları da bizi RLU ölçüm sonuçları belirli hücre satırı (enfekte olmayan koşul) taban ve parçacıklar (Δenv enfeksiyonu) hangi değil aracılık ettiği belirsiz içselleştirilmesi değerlendirmek izin gibi önemli viral zarf protein tarafından. İdeal olarak, verilen bir tür parçacık pseudotyped için bir viral zarf protein ilgi ile bu rakam 1A, Bburada gösterildiği gibi birkaç büyüklük negatif kontrol değerleri yüksek olan değerleri elde etmek için tavsiye edilir. Ancak, belli bir hücre türü için bir pseudotyped virüs enfeksiyonu çok az infektivite verirse (yani, yakın olmayan transfected N.T. koşullarda ‘ Resim 2deki gibiB böyle negatif denetimlere) bu mutlaka bu pseudotyped anlamına gelmez parçacık üretim hatalı. Bu iyi olabilir kullanılan belirli hücre satırı ya da kötü değil izin veren enfeksiyon için. Bu belli bir hücre türü enfeksiyona duyarlı olması soruşturuluyor virüs tarafından beklenen olup olmadığını kontrol etmek için tavsiye edilir. Viral receptor(s) daha verimli viral giriş ve enfeksiyon, gösterildiği Şekil 2B, transfection ACE2 ve DPP4 reseptörlerinin nerede üzerine yapılmasına izin verebilirsiniz plasmid(s) ifade transfecting kötü izin veren hücreler HEK-293T hedef hücreleri, bir ~ 4- ve ~ 2-günlük infektivite içinde sırasıyla artırmak. Plazmid/reaktif Miktar pCMV-MLVgagpol MLV gag ve plazmid kodlama pol 300 ng FTG-Luc transfer vektör luciferase muhabir ile 400 ng pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S veya boş vektör 300 ng İndirimli serum hücre kültür orta 50 µL Tablo 1: Plazmid ve düşük serum miktarda hücre kültürü 6-şey plaka HEK-293T/17 hücre pseudotyped parçacık üretim için bir şey transfect için gerekli orta. Plazmid hazırlıklar konsantrasyon, plazmid DNA gerekli miktarda ulaşmak için gerekli hacim hesaplamak. Birden fazla şey aynı Plasmid’ler ile transfected birimler tarafından kuyu transfect için gerekli sayıda çarpın ve hesaplamaları sonraki adımda karışımı azalmasını önlemek için ilave bir şey dahil. Toplam DNA transfected 1 µg/iyi miktarıdır. Plazmid yazarlar için istek üzerine mevcuttur. Reaktif Miktar Transfection reaktif 3 ΜL İndirimli serum hücre kültür orta 47 ΜL Tablo 2: transfection reaktif ve düşük serum miktarda hücre kültürü 6-şey plaka HEK-293T/17 hücre pseudotyped parçacık üretim için bir şey transfect için gerekli orta. Birimler tarafından kuyu transfect ve ilave wells Mix sonraki adımda azalmasını önlemek için hesaplamalar eklemek için gerekli sayıda çarpın. Transfection reaktif: kullanılan plazmid DNA oranı 3: 1’dir. Resim 1 : Coronavirus S-pseudotyped parçacık infektivite deneyleri bir fare lösemi virüs (MLV) omurga ve luciferase muhabir gen kullanarak duyarlı ana bilgisayar hücrelerdeki. (A)SARS-CoV S pseudotyped parçacık infektivite tahlil Vero-E6 hücrelerdeki. (B) MERS-CoV S pseudotyped parçacık infektivite tahlil ha-7 hücrelerdeki. Her iki (A) ve (B), çizilen veri karşılık gelen ortalama göreli luciferase birimlerine üç bağımsız deneylerden standart sapma (SD) karşılık gelen hata çubukları ile. Veri günlüğü10 ölçeğinde y ekseni üzerinde çizilen. N.I.: Sigara enfekte denetimi; Δenv: pseudotyped parçacıklar viral zarf glikoproteinlerin ve VSV Gpp eksik mantar enfeksiyonu: pseudotyped parçacıklar pozitif kontrol VSV G zarf glikoprotein taşıyan ile enfeksiyon. Kullanılan, diğer kısaltma SARS-Spp: SARS-CoV S ile enfeksiyon pseudotyped parçacıklar, MERS-Spp: MERS-CoV S ile enfeksiyon pseudotyped parçacıklar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Konsantrasyon-bağımlılık CoV S-pseudovirion infektivite ve rol SARS-Spp ve MERS-Spp girişindeki ACE2 ve DPP4 reseptörlerinin. (A)konsantrasyon-bağımlılık SARS-Spp ve MERS-Spp infektivite luciferase etkinliği tahlil tarafından ölçülür. Pseudovirions seri olarak seyreltilmiş ve Vero-E6 hücre bulaştırmak için kullanılır. (B) infektivite tahlil SARS-Spp ve MERS-Spp kötü keyfi HEK-293T hedef hücrelerde hızlı ACE2 için transfected ve DPP4 reseptörleri, anılan sıraya göre. Standart sapma (SD) karşılık gelen hata çubukları ile günlük10 ölçeğinde olduğu gibi Resim 1 y eksenindedir yinelenen deneyler, üzerinden veri çizilen. N.T.: Sigara transfected kontrol HEK-293T hücreleri; ACE2: Anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (SARS-CoV alıcı) ve DPP4: dipeptidyl peptidaz 4 (MERS-CoV reseptör). Diğer kısaltmalar kullanılan Resim 1ile aynıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Bu iletişim kuralı etkin bir şekilde risk grubu 3 coronaviruses, SARS-CoV ve MERS-CoV, BSL-2 ortamda S protein taşıyan pseudotyped parçacıklar üretmek için bir yöntem açıklanır. Bir luciferase muhabir gen dahil, bu parçacıklar bize kolayca coronavirus S-aracılı giriş olayları bir nispeten basit luciferase tahlil48,49,50,51tarafından ölçmek sağlar. Keyfi hücreleri kullanarak infektivite deneyleri içinde ölçülen luciferase aktivite parçacıklar konsantrasyon bağımlı olduğunu doğrulayın. Ayrıca, ACE2 ve DPP4 reseptör transfection HEK-293T hücreleri gibi kötü keyfi hücreleri satırında daha verimli giriş için izin verir. Yöntem diğer viral zarf glikoproteinlerin son derece uyarlanabilir ve yoğun kullanılan48,49,50,51,52,53, kez biyokimyasal analizler veya yerel virüs enfeksiyonları gibi diğer deneyleri tamamlayacak 55,56,57,58,–59.

Biz burada tarif Protokolü retrovirüsü luciferase muhabir birleştirmek MLV dayanır. Ancak, ambalaj coronavirus için S12,13,25,26, başarılı bir şekilde geliştirilmiştir diğer pseudotyping sistemleri çok geniş bir dizi olduğunu vurgulamak önemlidir 30 , 31 , 32 ve diğer viral zarf glikoproteinlerin10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. bazı bu diğer sistemlerin sık kullanılan MLV retroviral çekirdek7,8,9,10,11,12,13 temel alan ,14,15,16,17,18,19,20, veya yaygın olarak kullanılan lentiviral HIV-1 tarihinde pseudotyping sistemi kullanarak farklı stratejiler23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, veya rhabdovirus vesicular Stomatit virüs ile (VSV) olarak çekirdek sağlayan çeşitli dahil etmek için Zarf glikoproteinlerin ve yine çeşitli stratejileri37,38,39,40,41,42,43 istihdam ,44,45,46,47. Buna ek olarak, diğer gazeteciler floresan proteinler gibi GFP11,13 ve RFP36veya luciferase β-galaktozidaz16,17 gibi başka enzimler gibi ve salgılanan alkalen fosfataz (SEAP)42 başarıyla istihdam için ölçümleri. Ayrıca, bu protokol için sunulan assay olarak, geçici bir transfection MLV ve CoV S genler ve proteinler ifade etmek için kullanılmıştır. Ancak, ifade, örneğin, üretim pseudotyped virüs7,14için kararlı hücre satır oluşturma için diğer stratejileri vardır. Bu sistemlerin her biri gibi avantaj ve dezavantajları, hangi pseudotyping sistemini en iyi dedektif’ın ihtiyaçlarınıza uygun karar verirken aşağıdaki önemli parametreleri dikkate almak önemlidir: pseudovirion çekirdek (MLV, HIV-1, VSV veya diğerleri), nasıl belirli pseudotyping çekirdek bir belirli viral zarf glikoprotein, tahlil okuma (GFP, luciferase, SEAP veya diğer) için muhabir ve transfection strateji (plazmid eş transfection, geçici yer sayısı birleştirilerek seçicidir transfection veya istikrarlı hücre hatları nesil).

Vurgulamak için önemli olan kritik adımları yöntemi vardır. Hücre yoğunluğu, özellikle HEK-293T/17 yapımcı hücre kültürünü başarılı transfection sağlanmasında önemli bir faktördür. Bir hücre yoğunluğu % 40-60 confluency aralığındaki en uygun bulundu. Daha yüksek yoğunlukları genellikle düşük transfection verimliliği ve düşük parçacık üretim neden. Ayrıca, HEK-293T/17 hücreler daha az çok diğer hücre satır yapisan akılda tutmak önemlidir. Bakım onları gereksiz yere ayırma önlemek için işlerken edilmelidir. Hücre kültürü plastik yüzeyler bağlılık geliştirmek için Poli-D-lisin ile tedavi etmek için bir seçenektir. Ayrıca, daha yüksek hücre geçiş genellikle yoksul transfection fiyatlarına sonuçları. Transfection reaktif HEK-293T/17 hücrelere ekledikten sonra Ayrıca hücre geçirgenliği artar hatırlamak önemlidir. Bu yüzden bu noktada sitotoksisite arttıkça orta içeren antibiyotik kullanmaktan kaçınmak en iyisidir. Pseudotyped parçacıklar toplama önce transfected HEK-293T/17 hücre supernatants rengini kontrol edin. Genellikle, transfection, 48 saat sonra hücre kültür orta rengi turuncu-pembe belirti alır. Sarı renkli orta genellikle yoksul pseudotyped parçacıklar verimleri için çevirir ve sık sık hücre yoğunluğu veya yüksek geçit numarası tohum ile ilgili sorunlar bir sonucudur.

Bu protokolünde pseudotyped parçacık üretim bir 6-şey plaka biçimde gerçekleştirilir. Üretilen parçacıklar hacmi artırmak için bir 6-şey plaka birkaç kuyu aynı plazmid karışımı ile transfected ve supernatants birlikte havuza alınmış. Havuz sonra açıklık, filtre uygulanmış ve bölünmemeli olabilir. Alternatif olarak, üretimi, gemiler, diğer tür ölçeklemek için (örneğin, 25 veya 75 cm2 şişe) kullanılabilir. Bu durumda, transfection koşullar buna göre ölçekli olmalıdır. Bu protokol için infektivite tahlil bir 24-şey plaka biçimi ve sadece bir defada bir tüp ölçümleri sağlayan bir luminometer kullanılarak gerçekleştirilir. Yüksek işlem hacmi gösterimleri için diğer formatlar da 96-şey plaka biçimi ve bir plaka okuyucu luminometer gibi mümkündür. Birimler ve luciferase tahlil Kimyasalları buna göre adapte gerekir. Depolama birimi cryovials-80 ° C’de pseudotyped parçacıkların onların istikrar infektivite belirgin azalma olmadan birkaç ay tutar. Onları donma-çözülme çevrimleri gibi bu zaman içinde onların infektivite azaltacaktır için tabi tavsiye edilmez. Böylece, onları küçük aliquots 0.5-1 gibi depolamak en iyi mL ve onları daha önce bir enfeksiyon çözülme.

Burada sunulan yöntem bazı sınırlamaları vardır. Önemli bir pseudotyped parçacıklar sadece viral giriş olayları özetlemek gerçektir. Bulaşıcı yaşam döngüsü içinde diğer adımları çözümlemek için diğer deneyleri gereklidir. Ayrıca, MLV parçacıklar bud, plazma zarı çıkarmamak önemlidir gibi ihtiyaçları da plazma zarı birleşme için içine pseudovirions üretim sırasında trafik okudu zarf glikoprotein yenilmemiz umurumda. Bu nedenle, nerede hücreye belirli viral zarf glikoprotein transfection koşullarda gibi bir ayirt tahlil ile hücre altı yerelleştirme görüntülenmesi, ve/veya saklama sinyalleri içinde denetleme ifade edilir bilmek önemlidir protein. Protokol üretmek ve infektivite test adımları açıklar iken, aynı zamanda, bu viral zarf glikoproteinlerin birleşme pseudotyped parçacıkları içine ölçmek ayrıntılı nasıl değil. Western blot deneyleri MERS-CoV S birleşme için yukarıda açıklanan50,51 olarak parçacıkların, konsantre çözümleri gerçekleştirmek için bir yöntemdir. Bu deneyleri MERS-CoV S zarf glikoprotein bize S protein birleşme parçacıklar halinde normalize etmek izin olan MLV, (p30) kapsid protein ile birlikte probed. Bu tür deneyleri viral zarf glikoprotein birleşme pseudovirions içine analiz diğer örnekleri bir HIV-1 lentiviral pseudovirion sistem32 , Ebola glikoprotein (GP) başka bir MLV pseudotyped içinde SARS-CoV S birleşme için gerçekleştirilen Parçacık sistemi17ve grip hemagglutinin (HA) ve neuraminidase (NA) VSV pseudovirions38. Pseudotyped parçacık üretim karakterize içinde bir yeni gelişme Nanosight gibi yenilikçi görüntüleme cihazları kullanılır: doğrudan görselleştirmek, ölçmek ve viral parçacıkların50boyutu bize sağlar. Cihazın genel parçacık üretim üzerinde ayrıntılı bilgi sağlar; Ancak, bu zarf glikoprotein birleşme üzerinde bilgi sağlamaz akılda tutmak önemlidir. Bu çok yönlü pseudovirion parçacıklar uygulanması için gelecekteki yönünü tek parçacık izleme, havacilik ve toplam iç yansıma Floresans mikroskobu60,61 kullanarak bireysel viral füzyon olayları analiz etmektir ,62. Bu tür yaklaşımlar grip HA – ve NA-pseudotyped VSV tabanlı pseudovirions63yanı sıra grip virüsü ve kedi coronavirus parçacıklar başarıyla uygulandı. Bu tür teknikler coronavirus S pseudotyped MLV tabanlı parçacıklar uygulanan dağıtım şu anda geliştirilmektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tüm üyeleri, Whittaker ve Daniel labs yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Araştırma fonları NIH tarafından sağlanan R21 AI111085 ve R01 AI135270 verir. T.T. Cumhurbaşkanlığı hayat bilgisi bursu Cornell Üniversitesi ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu Program kapsamında hibe No desteğinden kabul eder. DGE-1650441. L.N. Samuel C. Fleming aile Yüksek Lisans Bursu ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans Araştırma Bursu Programı hibe No altında destek kabul eder. DGE-1650441. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı 1504846 (için S.D. ve G.R.W.) tarafından da desteklenir.

Materials

Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77 (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4 (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202, 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300 (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261 (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326 (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78 (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75 (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78 (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55 (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88 (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -. C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225 (2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393 (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321 (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166 (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305 (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87 (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85 (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84 (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206 (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446 (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436 (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161 (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59 (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84 (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88 (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10 (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34 (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169 (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5 (12), 126 (2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88 (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6 (23), 2035 (2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2′ region. Journal of General Virology. , (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285 (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83 (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393 (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -. Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34 (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -. Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29 (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -. L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537 (2016).

Tags

Pseudotyped ParticlesCoronavirusViral EntryBiosafety Level 2HEK293T CellsTransfectionPlasmid CotransfectionCell CultureCell DensityCell Morphology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image