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Immunology and Infection

Produção de partículas Pseudotyped para estudar a alta patogenicidade coronavírus em uma configuração de nível 2 de biossegurança

Published: March 01, 2019
doi:
10.3791/59010
, , , , , ,
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine,Cornell University, 2INRA, Virologie et Immunologie Moléculaires, 3Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering,Cornell University, 4Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences,Cornell University, 5Horae Gene Therapy Center,University of Massachusetts Medical School

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar pseudotyped partículas em um cenário de BSL-2 incorporando a proteína de aumento da síndrome respiratória do vírus de alta patogenicidade Oriente e coronavírus síndrome respiratória aguda grave. Estas partículas pseudotyped contêm um gene do repórter do luciferase permitindo a quantificação de entrada de vírus em células de host de destino.

Abstract

O protocolo visa gerar Proteína da fusão do coronavírus (CoV) pico (S) linha de células de pseudotyped partículas com murino leucemia vírus (MLV) núcleo e luciferase repórter, usando um procedimento simples de transfeccao do HEK-293T amplamente disponível. Uma vez formado e lançado de células de produtor, estes pseudovirions incorporam um gene do repórter do luciferase. Desde que apenas contêm os coronavirus heterólogos spike proteínas em sua superfície, as partículas se comportam como suas contrapartes de coronavirus nativo para etapas de entrada. Como tal, eles são os excelentes substitutos dos virions nativos para estudar a entrada viral em células hospedeiras. Mediante entrada bem-sucedida e infecção em células-alvo, o repórter do luciferase Obtém integrado no genoma da célula de acolhimento e é expresso. Usando um ensaio simples luciferase, transduzidas células podem ser facilmente quantificadas. Uma importante vantagem do procedimento é que pode ser realizada em Biossegurança nível 2 instalações (BSL-2) em vez de BSL-3 equipamentos necessários para o trabalho com alta patogenicidade coronavírus como Médio Oriente síndrome respiratória coronavirus (MERS-CoV) e coronavirus de síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV). Outro benefício vem de sua versatilidade como ele pode ser aplicado para as proteínas do envelope pertencentes a todas as três classes de proteínas da fusão viral, tais como a classe hemaglutinina gripe (HA) e da glicoproteína vírus Ebola (GP), o vírus de floresta de Semliki II classe E1 proteína ou glicoproteína vírus G classe III estomatite vesicular. Uma limitação da metodologia é que ele só pode recapitular as etapas de entrada de vírus mediadas pela proteína de envelope sendo investigada. Para estudar outras etapas do ciclo de vida viral, outros métodos são necessários. Exemplos das muitas aplicações em que destas partículas de pseudotipo podem ser usadas investigação da susceptibilidade de célula do hospedeiro e tropismo e testando os efeitos de inibidores de entrada de vírus para dissecar os caminhos de entrada viral usados.

Introduction

Entrada da pilha de anfitrião constitui os passos iniciais do ciclo de vida infeccioso viral. Para vírus envelopadas, isso envolve a ligação a um receptor de células host único ou vários receptores, seguidos por fusão de membranas celulares e virais. Essas funções essenciais são realizadas pelo envelope viral glicoproteínas1,2. A glicoproteína do envelope do coronavirus é chamada a proteína de pico (S) e é um membro da classe que viral fusão proteínas2,3,4,5,6. Estudar as glicoproteínas do envelope viral é fundamental para a compreensão de muitas características importantes de um determinado vírus, tais como: iniciação do ciclo de vida, seu anfitrião e tropismo celular, transmissão entre espécies, patogênese viral, bem como host de entrada de célula caminhos. Partículas virais pseudotyped, também chamadas pseudovirions, são ferramentas poderosas que permitem-nos facilmente estudar a função das proteínas de fusão viral. Pseudotyped partículas ou pseudovirions são virions quiméricoes que consistem de um núcleo viral substituto com uma proteína do envelope viral heteróloga em sua superfície. A finalidade principal do protocolo é mostrar como obter coronavirus spike pseudotyped partículas que baseiam-se em um núcleo de vírus (MLV) murino leucemia e contêm um gene do repórter do luciferase. Como exemplos, são apresentados o método para produzir pseudotyped partículas com as proteínas de pico de alta patogenicidade síndrome respiratória aguda grave (SARS) e Médio Oriente síndrome respiratória (MERS) coronavírus. O protocolo descreve o procedimento de transfeccao envolvido, como alvo suscetível de infectar as células e quantificação de infecciosidade por ensaio de luciferase.

Desde que as etapas de entrada das pseudovirions são regidas pelo coronavirus S em sua superfície, entram as células de forma semelhante às contrapartes nativos. Como tal, eles são excelentes substitutos dos ensaios de infecciosidade funcional. Pseudotyped partículas geralmente são derivadas de vírus, modelo parental como retrovírus (MLV7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 e o vírus da imunodeficiência humana de lentivirus — HIV23,24,25,26,,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) ou rhabdoviruses (vírus da estomatite vesicular — VSV36,39,40,41,42,,43,44 , 45 , 46 , 47). quando usado em pseudotyping, genomas do vírus parental são modificadas para remover os genes essenciais, tornando-as com defeito para a realização de um ciclo de replicação completa. Esta característica permite que eles sejam utilizados em instalações de nível intermediário de biossegurança (BSL-2) e é uma importante vantagem sobre usando vírus nativos altamente patogénicos que exigem maiores facilidades de biossegurança (BSL-3, que não são tão facilmente disponível BSL-4) quando a realização de estudos de entrada de vírus. Aqui, as proteínas S de risco grupo 3 patógenos SARS-CoV e MERS-CoV são usados como exemplos de proteínas do envelope viral a ser incorporadas na MLV pseudotyped partículas, gerando pseudovirions de SARS-CoV S e S de MERS-CoV (SARS-Spp e MERS-Spp, respectivamente). Esses pseudovirions têm sido utilizados com sucesso em estudos com foco em eventos de entrada destes vírus48,,49,50,51. Outra vantagem é que a técnica descrita aqui não é limitada às proteínas de coronavirus S pseudotyping: é muito flexível e pode ser usado para incorporar representantes de todas as três classes de proteínas da fusão viral. Exemplos incluem hemaglutinina gripe (HA, classe I)52, glicoproteína do vírus Ebola (GP classe I), proteína E1 do vírus de floresta de Semliki alphavirus (SFV, classe II) e glicoproteína VSV (G, classe III)53. Além disso, mais de um tipo de glicoproteína viral pode ser co incorporado em uma partícula pseudotyped, como no caso da gripe HA – e at – pseudotyped partículas51.

Baseado no trabalho realizado por Santos et al.20, este protocolo descreve a geração de MLV pseudotyped partículas com uma estratégia de três-plasmídeo co transfeccao usando o HEK-293T amplamente disponível e altamente competentes de transfecção celular linha 54. o plasmídeo primeiro codifica o MLV núcleo genes gag e pol mas não possui o gene de env envelope MLV. O plasmídeo segundo é um vetor de transferência que codifica um gene repórter de vagalume luciferase, um sinal de empacotamento de Ψ-RNA MLV, junto com os 5′-3′-flanqueando MLV repetição tempo terminal (LTR) regiões e. O terceiro plasmídeo codifica a proteína de fusão de interesse, neste caso também a proteína de SARS-CoV S ou S de MERS-CoV. Em cima co transfeccao dos três plasmídeos usando um reagente de transfeccao, viral RNA e proteínas se expressa dentro de células transfectadas, permitindo a geração de partículas pseudotyped. Desde MLV é usado como espinha dorsal de pseudovirion, isto ocorre na membrana plasmática: os RNAs contendo o repórter de gene do luciferase e sinal de embalagem obter encapsulados em partículas nascentes que incorporam também a membrana plasmática-expresso coronavirus spike proteínas. As partículas que brote para fora das células contêm a proteína coronavirus S em sua superfície e são colhidas para utilização em ensaios de infecciosidade. Porque pseudotyped partículas do porto a proteína coronavirus S e não a proteína de envelope MLV, quando usado para infectar as células, elas se comportam como suas contrapartes de coronavirus nativo para etapas de entrada. O RNA viral contendo o repórter do luciferase e flanqueando LTRs em seguida é liberado dentro da célula e as atividades do polymerase retroviral habilitar sua transcrição reversa no DNA e integração no genoma da célula de acolhimento. Quantificação da infectividade de partículas pseudotyped virais em células infectadas, em seguida, é executada com um ensaio de atividade simples luciferase. Porque a sequência de DNA que fica integrada no genoma da célula de acolhimento só contém o gene da luciferase e nenhum dos genes da proteína-codificação MLV ou coronavírus, eles são inerentemente mais seguros de usar do que a replicação vírus nativos.

Além de ser substitutos mais seguros e altamente adaptável para permitir a incorporação de vários tipos de glicoproteínas do envelope, as partículas pseudotyped aqui descritas são também altamente versátil e podem ser usadas para estudar muitos aspectos da entrada de vírus. Isto inclui mas não está limitado a: susceptibilidade de célula hospedeiro à infecção do vírus de teste, analisando os caminhos de entrada celular usa um vírus envelopado, estudando os efeitos de inibidores farmacológicos e exibições de droga, conduzindo o anticorpo de neutralização ensaios, caracterizando a entrada da pilha de anfitrião de envelopada vírus que não pode ser cultivadas e gerando vetores virais para a entrega do gene, estável celular expressão de genes de interesse, ou silenciamento de genes.

Protocol

1. célula de semeadura para a produção de partículas Pseudotyped Nota: Execute esta etapa na biossegurança do armário. Através de técnicas de cultura de pilha padrão, obter um balão de2 confluente 75cm 80 – 90% de células HEK-293T/17 passadas em completa Dulbecco médio da águia modificado (DMEM-C) que contém 10% (vol/vol) de soro fetal bovino (FBS), 10 mM 4-(2-hidroxietil) -1- ácido piperazineethanesulfonic (HEPES), penicilina 100 UI/mL e 100 µ g/mL Estreptomicina. Prepare meio DMEM-T para transfections (sua composição é a mesma como DMEM-C, mas sem antibióticos). Lavam-se duas células com 10 mL de pré-aquecido (37 ° C) Dulbecco fosfato Buffered Saline (DPBS).Nota: Lidar com células HEK293T/17 com cuidado como eles facilmente separar. Aspirar o sobrenadante e separar as células com 1 mL de solução de tripsina 0,25% pré aquecida a 37 ° C. Coloque o frasco de células a 37 ° C, 5% CO2 incubadora para 3−5 min ou até as células começam a desanexação.Nota: Evite células com tripsina por mais de 5 min da incubação como isto normalmente leva a aglutinação de células. Desactive a tripsina, adicionando 4 mL de DMEM-C médio e contagem de células usando uma célula contando o slide e o microscópio de luz.Nota: Para evitar ter que contar muitas células, uma etapa de diluição adicional pode ser exigida antecipadamente. Lembre-se de considerar esta diluição ao calcular a densidade de células reais de células trypsinized. Diluir as células de 5 x 105 células/mL com DMEM-C. Placa de cultura de tecidos de 6-poços com 2 mL da solução de células por poço de sementes e suavemente mova a placa e para trás e lado a lado para distribuir uniformemente as células, evitando o movimento circular.Nota: Este é um passo fundamental. Células uniformemente distribuídas irão garantir que as células não aglutinar-se no centro de poços. Por sua vez, isso garantirá a transfeccao boa eficiência e partículas pseudotyped produção. Incube a placa durante a noite (16 – 18 h) a 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultura celular. 2. três-plasmídeo transfection co Nota: Execute esta etapa na biossegurança do armário. Observe as células sob um microscópio invertido para verificar a morfologia celular e densidade.Nota: Idealmente, a densidade celular deve ser na faixa de confluencia de 40 – 60%. É fundamental que as células são também muito confluente (80−90% confluente) nem muito escassamente distribuídos (20−30% confluente) em cada poço. Uma densidade de células de 40−60% confluência garantirá a produção de partículas pseudotyped bom. Mistura de plasmídeos Calcule a mistura do plasmídeo para cada glicoproteína do envelope seguindo as quantidades para um poço de uma placa de 6 mostrados na tabela 1. Multiplicar as quantidades se transfecting vários poços e incluem um extra bem para evitar a falta de mistura.Nota: Junto com a SARS-CoV S e S de MERS-CoV codificação plasmídeos, incluem controle de vetor vazio para a geração de partículas de controlo negativo que falta glicoproteínas do envelope viral (partículas Δenv) junto com uma glicoproteína de controlo positivo como vesiculares glicoproteína de vírus (VSV) G estomatite que é conhecida por robustamente infectar uma grande variedade de células (VSV-Gpp). Plasmídeos estão disponíveis mediante pedido. Misture volumes calculados de plasmídeos e meio de cultura celular de soro reduzida (ver Tabela de materiais) em um tubo de microcentrifugadora. Reagente de transfeccao baseada em lipídios mix (ver Tabela de materiais) Calcule os volumes para a mistura de reagente de Transfeccao de quantidades indicadas na tabela 2 para um poço (1:3 relação de transfeccao, multiplicar quantidades conforme necessário). Incluem poços extras para evitar a falta de mistura de reagente de transfeccao. Misturar volumes calculados de reagente de transfeccao baseada em lipídios (3 µ l por alvéolo) e o meio de cultura celular reduzida soro (47 µ l por alvéolo) em um tubo de microcentrifugadora, certificando-se de adicionar o reagente de transfeccao em meio de cultura de célula soro reduzida e não o contrário ao redor. Incubar as duas misturas (por um bem: 50 µ l de plasmídeos misturar e 50 µ l de reagente de transfeccao baseada em lipídios misturar) separadamente por 5 min à temperatura ambiente. Adicione o conteúdo da mistura de reagente de Transfeccao para plasmídeos mistura na proporção de 1:1 (para o bem de 1: 50 µ l de cada mistura) Realize minuciosa pipetagem de cima para baixo da mistura resultante. Incube a mistura pelo menos 20 min em temperatura ambiente. Aspire o gasto médio das células. Adicione delicadamente a 1 mL de meio de cultura celular previamente aquecido (37 ° C) soro reduzida por bem. Adicionar gota a gota 100 µ l de mistura de Transfeccao para cada poço.Nota: Tenha cuidado ao adicionar a mistura de Transfeccao para poços de HEK-293T como eles separar facilmente. Incube as células em um 37 ° C, incubadora de cultura de célula 5% CO2 para 4-6 h. Adicionar 1 mL por bem de meio de DMEM-T previamente aquecido (37 ° C), que não contém antibióticosNota: Este é um passo fundamental. Reagentes de transfecção aumentam a permeabilidade celular e aumentam a sensibilidade aos antibióticos. Para garantir a transfeccao boa eficiência e produção de partículas pseudotyped, é importante evitar o uso de meio de cultura celular contendo antibióticos Incube as células em um 37 ° C, incubadora de cultura de célula 5% CO2 por 48 h. 3. pseudotyped partículas coleção Nota: Execute esta etapa na biossegurança do armário. Observe células sob o microscópio invertido para verificar a morfologia celular e condição geral. Verifique também a cor do meio que deve ser luz rosa/ligeiramente laranja.Nota: Este é um passo importante. Se houver muita morte celular associada o transfeccao ou a cor média virado laranja/amarelo (pH ácido), geralmente estará associado com rendimentos mais baixos em partículas infecciosas pseudotyped Transferi sobrenadantes de células transfectadas para tubos de centrifuga conico de 50 mL. Centrifugar tubos a 290 x g durante 7 min remover os resíduos de célula. Filtro sobrenadantes clarificados através de um filtro estéril 0,45 µm poro de tamanho. Fazer alíquotas de pequeno volume (por exemplo., 500 µ l ou 1 mL) de solução de vírus pseudotyped em cryovials. Loja a-80 ° C.Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Pseudotyped partículas são estáveis a-80 ° C por muitos meses, mas uma vez descongelado, evitar re-congelá-los como eles perdem infecciosidade 4. pseudotyped partículas infecção de células susceptíveis Nota: Execute esta etapa na biossegurança do armário. Célula a propagação das células suscetíveis em placa de 24 Obter por célula padrão cultura técnicas 80−90% confluentes 75 cm2 frasco de células susceptíveis: células Vero-E6 para SARS-CoV pseudotyped partículas (SARS-Spp) e Huh-7 células para MERS-CoV S pseudotyped partículas (MERS-Spp).Nota: Para confirmar se o pseudotyped partículas que tenham sido produzidas são infecciosas, é importante escolher cuidadosamente uma linha de célula apropriada suscetível para ensaios de infecciosidade pseudovirion. Usar células mal permissivas levará a baixa infecciosidade. Lave as células duas vezes com 10ml de pré-aquecido (37 ° C) DPBS. Aspirar o sobrenadante e separar as células com 1 mL de solução de tripsina 0,25% pré aquecida a 37 ° C. Coloque o frasco de células a 37 ° C, 5% CO2 incubadora para 3−5 min ou até as células começam a desanexação.Nota: Evite células com tripsina a incubar por mais de 5 minutos como isto normalmente leva a aglutinação de células. Células-7 são especialmente sensíveis a este efeito. Desactive a tripsina adicionando DMEM-C médio e contagem de células usando uma célula contando o slide e o microscópio de luz. Diluir as células de 5 x 105 células/mL com DMEM-C. Poços de semente de um 24-poço da placa com 0,5 mL da solução de célula por bem e suavemente mova a placa e para trás e lado a lado para distribuir uniformemente as células, evitando o movimento circularNota: Este é um passo fundamental. Células uniformemente distribuídas irão garantir que as células não aglutinar-se no centro de poços. Por sua vez, isso garantirá a infecciosidade bons ensaios. Para cada partícula pseudotyped (SARS-Spp, MERS-Spp) e condição, prepare três poços para três repetições experimentais. Incluem poços de não infectados (Ni), partículas de Δenv vetor vazio e partículas de controlo positivo como VSV-Gpp Incubar a placa durante a noite (16−18 h) a 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultura celular Infecção pseudotyped partículas Observar células sob o microscópio de luz e visualmente, confirme se há um tapete confluente das células. Trazer cryovials de vírus pseudotyped para descongelar no gelo. Células de lavar três vezes com 0,5 mL pré aquecido (37 ° C) DPBSNota: Este é um passo fundamental. Células que não são devidamente lavadas antes da infecção normalmente levam a leituras de infecciosidade pobre Aspire os sobrenadantes de células. Inocule células com 200 µ l de solução de partícula pseudotyped descongelado. Incube as células em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultura celular para 1−2 h. Adicione 300 µ l de pré-aquecido (37 ° C) meio DMEM-C. Incube as células em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora de cultura celular para 72 h. 5. infecciosidade quantificação por Luciferase ensaio leitura Nota: Realizar os primeiros passos no armário a biossegurança. Substrato de Luciferina de degelo (armazenado a-80 ° C) e 5 x luciferase ensaio do lysis (armazenado a-20 ° C) até atinja a temperatura. Dilua o tampão de lise de ensaio do luciferase para 1x com água estéril. Aspire sobrenadantes de células infectadas com partículas pseudotyped. Adicione 100 µ l de tampão de lise de ensaio de luciferase 1 x a cada poço. Coloque a placa sobre um roqueiro e incube por 15 min com balanço à temperatura ambiente (a partir deste momento que a placa pode ser tratada fora de uma gabinete de biossegurança). Prepare microcentrifuga tubos para cada poço, acrescentando 20 µ l de substrato luciferina em cada tubo. Ligue o luminómetro. Realizar medição de atividade de luciferase um bem cada vez pela transferência de 10 µ l de lisado para um tubo contendo 20 µ l de substrato luciferina. Agite o tubo delicadamente para misturar o conteúdo, mas evitar deslocando o líquido nas paredes do tubo. Colocar o tubo no dispositivo e feche a tampa. Medir o valor de luminescência do tubo usando o luminómetro. Registro de medição da unidade luz relativa. Repita as etapas de 5.8 – 5.12 até que todos os poços são analisados.Nota: Com o equipamento apropriado como uma placa lendo luminómetro, este processo pode ser executado automaticamente. O ensaio precisa ser dimensionado para o placa formato (por exemplo,, placa de 96 poços). 6. análise de dados Cálculo e plotagem de médias e desvios-padrão das unidades do luciferase relativo Use um gráfico de plotagem software para calcular a média de medição do ensaio de luciferase e replica os desvios-padrão de experimental e biológica. Plotar dados como gráfico de barras com desvios-padrão.Nota: Ao realizar análises estatísticas de dados, certifique-se de incluir pelo menos três repetições biológicas em conjuntos de dados.

Representative Results

Resultados representativos dos ensaios de infecciosidade de SARS-CoV S e S de MERS-CoV pseudotyped partículas são mostradas na Figura 1. Como esperado, para ambas as Figura 1A e 1B, a VSV G pseudotyped positivo controle partículas (VSV-Gpp) deram muito alta infectividade média no 10 faixa de6 a 107 unidades de luciferase relativa (RLU) respectivamente. Para SARS-CoV S infecção pseudotyped partículas (Figura 1A) de células Vero-E6 susceptíveis, uma forte média infecciosidade foi medida em cerca de 9,8 x 104 RLU. Esse valor é quase 3 ordens de magnitude maior do que os valores medidos para o controle não infectados (1,1 x 102 RLU), ou as partículas de Δenv (1,5 x 102 RLU), que não abriga qualquer glicoproteínas do envelope viral em sua superfície. Da mesma forma, para MERS-CoV S infecção pseudotyped partículas (Figura 1B) de células Huh-7, uma alta infectividade média foi medida em cerca de 1,0 x 106 RLU. Isto é quase 4 ordens de magnitude maior do que os valores medidos para o controle não infectados (0,8 x 102 RLU), ou as partículas Δenv (2.0 x 102 RLU). Realizou-se um ensaio adicional infecciosidade em que a SARS-Spp e MERS-Spp foram serialmente diluída e usado para infectar células Vero-E6(Figura 2). Este teste confirma que a atividade de luciferase medida é dependente da concentração das partículas usadas para infectar as células. Para confirmar o papel da enzima conversora da angiotensina 2 (ACE2) e Dipeptidil peptidase 4 (DPP4), os receptores de SARS-CoV e MERS-CoV, respectivamente, na mediação de ligação e entrada das partículas pseudotyped, usamos mal-permissiva células HEK-293T e transfectadas para expressar ou ACE2 ou DPP4 (Figura 2B). As células transfectadas foram então usadas para um ensaio de infecciosidade. Esta análise demonstra que a superexpressão de ACE2 e DPP4, há um aumento de ~ 4-log e log-~ 2 para infecciosidade SARS-Spp e MERS-Spp, respectivamente, confirmar que o uso do receptor de pseudovirions é semelhante do vírus nativos. Os exemplos mostrados aqui demonstram a importância de incluir negativa (não infectados, Δenv partículas) bem como as condições de controlo positivo (VSV-Gpp) ao produzir partículas pseudotyped. Com efeito, as partículas de controlo positivo VSV-Gpp nos permitem avaliar se um determinado lote de pseudotyped partículas foi bem sucedido em rendendo pseudovirions funcionais e infecciosas. Resultados esperados da infecção típica por partículas de VSV-Gpp em células de mamíferos mais linhas estão na faixa RLU de7 de − 10610. Problemas com células de produtor de HEK-293T/17 (número de passagem elevada, problemas com densidades de célula) ou eficiências de transfeccao pobre podem afetar a produção de partículas pseudotyped global e infecciosidade. Além disso, as condições de controlo negativo também são importantes como eles nos permitem avaliar as linhas de base das medições RLU em uma linha de celular particular (condição de não-infectadas) e internalização de específico de partículas (Δenv infecção) que não é mediada por uma proteína do envelope viral. Idealmente, para um determinado tipo de partícula pseudotyped com uma proteína do envelope viral de interesse, é recomendável para obter valores que são algumas ordens de magnitude maior do que os valores de controlo negativo, como aqui mostrado na Figura 1A, B. No entanto, se para um tipo de célula de determinado uma infecção de vírus pseudotyped dá muito pouco infecciosidade (ou seja, perto de, para controles negativos tais como ilustrado na Figura 2B em condições não-transfectadas do N.T.) isso não significa necessariamente que o pseudotyped produção de partículas estava com defeito. Pode ser que não é a linha de celular particular usada ou mal permissiva à infecção. Recomenda-se verificar se um tipo de dado da célula deverá ser suscetíveis à infecção pelo vírus a ser investigado. Transfecting células mal permissivas com plasmid(s) expressando que o receptor viral pode permitir entrada viral mais eficiente e infecção ocorrer, como mostrada na Figura 2B, onde em cima de Transfeccao de receptores ACE2 e DPP4 no alvo HEK-293T células, existe um ~ 4- e ~ 2-log de aumento da infectividade, respectivamente. Plasmídeo/reagente Quantidade pCMV-MLVgagpol MLV mordaça e pol codificação do plasmídeo 300 ng vetor de transferência pTG-Luc com repórter do luciferase 400 ng vector pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S ou vazio 300 ng Meio de cultura celular de soro reduzida A 50 µ l Tabela 1: quantidades de plasmídeos e soro reduzido celular meio de cultura necessário para transfect um poço de uma placa de células HEK-293T/17 para a produção de partículas pseudotyped 6. Resultantes da concentração dos preparativos do plasmídeo, calcule o volume necessário para atingir a quantidade necessária de plasmídeo. Se mais de um bem é transfected com o mesmo plasmídeo, multiplicar volumes pelo número necessário de poços de transfect e incluem um extra bem nos cálculos para evitar a falta de mistura em etapas posteriores. A quantidade total de DNA sendo transfectada é 1 µ g/poço. Plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação aos autores. Reagente Quantidade Reagente de transfeccao 3 Μ l Meio de cultura celular de soro reduzida 47 Μ l Tabela 2: quantidades de reagente de transfeccao e soro reduzido celular meio de cultura necessário para transfect um poço de uma placa de células HEK-293T/17 para a produção de partículas pseudotyped 6. Multiplica os volumes pelo número necessário de poços transfect e incluir poços extras nos cálculos para evitar a falta de mistura em etapas posteriores. O reagente de transfeccao: rácio de DNA de plasmídeo utilizado é de 3:1. Figura 1 : Ensaios de infecciosidade Coronavirus S-pseudotyped partículas nas células hospedeiras sensíveis usando murino leucemia vírus (MLV) espinha dorsal e luciferase repórter gene. (A) ensaio de infecciosidade SARS-CoV S pseudotyped partículas em células Vero-E6. (B) ensaio de infecciosidade MERS-CoV S pseudotyped partículas nas células Huh-7. Para tanto (A) e (B), dados plotados correspondem as unidades de luciferase relativa média de três experimentos independentes, com barras de erro correspondente ao desvio-padrão (s.d.). Dados plotados em escala de10 log no eixo y. N.I.: controle de não-infectados; Δenv: infecção com partículas pseudotyped falta de glicoproteínas do envelope viral e VSV-Gpp: infecção com pseudotyped partículas tendo controlo positivo VSV G glicoproteína do envelope. Outra abreviação usada, SARS-Spp: infecção com SARS-CoV S pseudotyped partículas, MERS-Spp: infecção com S MERS-CoV pseudotyped partículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Concentração-dependência da infecciosidade CoV S-pseudovirion e o papel dos receptores ACE2 e DPP4 na entrada de SARS-Spp e MERS-Spp. (A) concentração-dependência da infecciosidade SARS-Spp e MERS-Spp, medida pelo ensaio da atividade do luciferase. Pseudovirions em série foram diluídos e usados para infectar as células Vero-E6. Infecciosidade (B) ensaio de SARS-Spp e MERS-Spp em células-alvo mal permissivas HEK-293T transfectado com ACE2 expressa e receptores de DPP4, respectivamente. Dados plotados em escala de10 log no eixo y, como na Figura 1 de experiências duplicadas, com barras de erro correspondente ao desvio-padrão (s.d.). N.T.: células de controle não-transfectadas HEK-293T; ACE2: conversora enzima 2 (receptor de SARS-CoV) e DPP4: Dipeptidil peptidase 4 (receptor de MERS-CoV). Outras abreviaturas utilizadas são as mesmas como na Figura 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo descreve um método para produzir eficientemente pseudotyped partículas tendo a proteína S de risco grupo 3 coronavírus, SARS-CoV e MERS-CoV, num cenário de BSL-2. Estas partículas, que incorporam um gene do repórter do luciferase, nos permitem facilmente quantificar coronavirus eventos de entrada de S-mediada por um relativamente simples do luciferase ensaio48,,49,50,51. Em ensaios de infecciosidade usando células permissivas, confirmamos que a atividade de luciferase medida é dependente da concentração de partículas. Além disso, ACE2 e DPP4 transfecção do receptor permite a entrada mais eficiente em linhas mal permissiva células, como células HEK-293T. O método é altamente adaptável a outras glicoproteínas do envelope viral e tem sido amplamente utilizado48,,49,50,,51,52,53, 55,56,57,58,59, muitas vezes para complementar outros ensaios como análises bioquímicas ou infecções de vírus nativo.

O protocolo que descrevemos aqui se baseia o retrovírus MLV que incorpora um repórter do luciferase. No entanto, é importante salientar que há uma gama muito ampla de outros sistemas de pseudotyping que foram desenvolvidos com sucesso para embalagens coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 e outro envelope viral glicoproteínas10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. alguns desses outros sistemas baseiam-se na comumente usados MLV retroviral núcleo7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, ou com base no HIV-1 de Lentivirus amplamente utilizado sistema pseudotyping usando diferentes estratégias23,24,25,26,,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, ou com o Rhabdovírus estomatite vesiculosa vírus (VSV) como o núcleo, que permite incorporar uma grande variedade de glicoproteínas do envelope e novamente com várias estratégias empregavam37,38,39,40,41,42,43 ,44,,45,46,47. Além disso, outros repórteres como proteínas fluorescentes como GFP11,13 e RFP36ou enzimas além do luciferase como β-galactosidase16,17 e secretado fosfatase alcalina (SEAP)42 têm sido empregadas com sucesso para medições. Além disso, no ensaio apresentado no presente protocolo, uma transfecção transiente foi usada para expressar a MLV e CoV S genes e proteínas. No entanto, existem outras estratégias de expressão, tais como a geração de linhas celulares estável para a produção de vírus pseudotyped7,14. Como cada um desses sistemas têm suas vantagens e desvantagens, é importante considerar os seguintes parâmetros importantes ao decidir qual sistema pseudotyping melhor se adapte às necessidades do investigador: pseudovirion core (MLV, HIV-1, VSV ou outros), como seletiva um núcleo pseudotyping particular é incorporar uma glicoproteína do envelope viral específico, repórter de leitura do ensaio (GFP, luciferase, SEAP ou outros) e a estratégia de transfeccao (número de plasmídeos envolvidos na co transfeccao, transitório transfecção ou geração de linha celular estável).

Há uma série de passos críticos no método que são importantes para enfatizar. Densidade de células, particularmente da linha celular HEK-293T/17 produtor é um fator crítico na garantia de sucesso do transfection. Uma densidade de célula no intervalo de 40 – 60% confluência foi encontrada para ser o ideal. Densidades maiores normalmente resultam em eficiências de transfeccao baixa e partículas de baixa produção. Além disso, é importante manter em mente que as células HEK-293T/17 são menos aderentes do que outras linhas de célula. Deve ter cuidado ao manuseá-los para evitar desanexando-los desnecessariamente. Uma opção é o tratamento de superfícies de plástico de cultura celular com poli-D-lisina para melhorar a aderência. Além disso, a maior passagem de célula muitas vezes resulta em taxas de transfeccao pobre. Após a adição do reagente de Transfeccao para células HEK-293T/17, também é importante lembrar que aumenta a permeabilidade celular. É por isso que neste momento é melhor evitar o uso de antibióticos contendo médios como eles podem aumentar a citotoxicidade. Antes de coletar partículas pseudotyped, verifique a cor do sobrenadantes de células transfectadas HEK-293T/17. Geralmente, após 48 h de transfeccao, a cor do meio de cultura celular leva uma coloração laranja-de-rosa. Meio amarela geralmente se traduz em rendimentos de partículas pseudotyped pobre e é frequentemente um resultado de problemas com o celular semeadura densidade ou número elevado de passagem.

Neste protocolo, pseudotyped partículas de produção é realizada em um formato de placa 6. Para aumentar o volume de partículas produzidas, vários poços de uma placa de 6 podem ser transfected com a mesma mistura de plasmídeos e os sobrenadantes podem ser agrupados. A piscina pode então ser clarificada, filtrada e aliquotadas. Alternativamente, a escala de produção acima, outros tipos de embarcações (por exemplo, 25, ou frascos de 75 cm2 ) podem ser usados. Neste caso, as condições de transfeccao devem ser dimensionadas em conformidade. Neste protocolo, o ensaio de infecciosidade é executado usando um formato 24-placa e um luminómetro que só permite medições um tubo de cada vez. Para seleções de alto rendimento, outros formatos também são possíveis, tais como o formato da placa de 96 poços e um luminómetro de leitor de placa. Volumes e reagentes para o ensaio do luciferase precisam ser adaptadas em conformidade. Armazenamento de partículas pseudotyped em cryovials a-80 ° C mantém sua estabilidade durante vários meses sem diminuição perceptível da infecciosidade. Não é recomendável para submetê-los para ciclos de congelamento e descongelamento como isto irá diminuir sua infectividade ao longo do tempo. Assim, é melhor para armazená-los em pequenas alíquotas como 0,5 – 1 mL e descongelá-los antes de uma infecção.

O método apresentado aqui tem várias limitações. Importante é o fato de que pseudotyped partículas recapitular os eventos de entrada apenas viral. Para analisar outras etapas do ciclo de vida infeccioso, outros ensaios são necessários. Além disso, como MLV partículas bud na membrana plasmática, é importante ter em mente que a glicoproteína do envelope sendo estudada precisa para também o tráfego para a membrana plasmática para a incorporação de pseudovirions durante a produção. Como tal, é importante saber onde na célula uma glicoproteína do envelope viral específica é expressa em condições de transfeccao, tais como através da visualização Localização subcellular com um ensaio de imunofluorescência, e/ou verificando sinais de retenção dentro a proteína. Também, enquanto o protocolo descreve as etapas para produzir e testar a infecciosidade, ele não detalha como medir incorporação pseudotyped partículas de glicoproteínas do envelope viral. Um método é para realizar ensaios de borrão ocidental em soluções concentradas de partículas, como descrito anteriormente,50,51 para incorporação de MERS-CoV S. Nestes ensaios, a glicoproteína do envelope S de MERS-CoV é analisada juntamente com a proteína do capsídeo (p30) do MLV, que nos permitem normalizar a incorporação da proteína S em partículas. Outros exemplos de tais ensaios analisando a incorporação de glicoproteína do envelope viral em pseudovirions foram executados para incorporação de SARS-CoV S em um HIV-1 pseudovirion Lentivirus sistema32 , Ebola glicoproteína (GP) em outra MLV pseudotyped sistema de partículas17e hemaglutinina gripe (HA) e neuraminidase (NA) em VSV pseudovirions38. Um desenvolvimento recente em caracterizar a produção de partículas pseudotyped é o uso de dispositivos de imagem inovadoras, tais como Nanosight: permite-nos Visualizar diretamente, quantificar e tamanho de partículas virais50. O dispositivo fornece informações detalhadas sobre a produção total das partículas; no entanto, é importante ter em mente que ele não fornece informações sobre a incorporação de glicoproteína do envelope. Um rumo para a aplicação destas partículas pseudovirion versátil é analisar eventos de fusão viral individual usando a única partícula de rastreamento, microfluídica e reflexão interna total da fluorescência microscopia60,61 ,,62. Essas abordagens foram aplicadas com êxito para vírus da gripe e coronavírus felino partículas, bem como da gripe HA – e at-pseudotyped baseada em VSV pseudovirions63. A implantação de tais técnicas aplicadas para coronavirus S-pseudotyped partículas baseadas em MLV atualmente está sendo desenvolvida.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a todos os membros dos laboratórios de Whittaker e Daniel para comentários úteis. Financiamento de pesquisa foi fornecido pelo NIH concede R21 AI111085 e AI135270 do R01. T.T. reconhece apoio da comunhão Life Science presidencial na Cornell University e a National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program sob Grant no. DGE-1650441. L.N. reconhece o suporte de um Samuel C. Fleming família Graduate Fellowship e o National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program sob Grant no. DGE-1650441. Este trabalho também é apoiado pela 1504846 de fundação de ciência nacional (a S.D. e G.R.W.).

Materials

Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100
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Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).
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