T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması
Summary
Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.
Abstract
Sinyal iletimi arabulucu çok sayıda yol oluşur T-hücre reseptör (TCR) TCR harekete geçirmek sinyalleri. Farklı stratejileri önerdi ve yeni arabulucu TCR sinyal, ve T-hücre süreçlerini harekete geçirmek ve timik seçimi de dahil olmak üzere, anlayış geliştirmek tanımlanması için uygulanan. Biz timositleri geliştirme harekete geçirmek üstünde dayalı TCR sinyal etkisi molekülleri tanımlaması sağlar bir tarama yöntemi açıklanmaktadır. Güçlü TCR sinyalleri apoptotik makine negatif seçimi olarak bilinen bir işlem içinde etkinleştirmek gelişmekte olan timositleri neden. Kinaz inhibitörleri uygulanması yoluyla, bu TCR sinyal etkiler hedefleri ile negatif seçim sürecinin geçersiz kılmak edebiliyoruz. Bu yazıda ayrıntılı Yöntem TCR sinyal yolları içinde kurulan rollerle kurallı kinaz inhibitörleri ve TCR sinyal yolları henüz kurulacak yeni kinaz inhibitörleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada tarama strateji TCR sinyal içinde roman druggable hedefleri tanımlanması için daha yüksek aktarıma filtrelerine uygulanabilir.
Introduction
Edinilmiş bağışıklığın tamirhanede bir rol oynamak lenfositler soyundan T hücrelerdir. Her hangi bir antijen sunma yüzeylerde bulunan sağlayan onları onların ligandlar, MHC kompleksi molekülünün (MHC) oluşan komplekslerin tanımak ile ilişkili peptid TCR ifade hücreleri (ZPT). Yolu TCR/MHC etkileşimi aracılığıyla sinyal TCR tetikleme T Hücre aktivasyonu ve geliştirme1için çok önemlidir.
T-hücre gelişiminde nerede farklılaşma geçmesi ve T hücreli lineage ilerleme2aşamalarında git timus, kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre (HSCs) göç. Çift-pozitif (DP) timositleri, CD4 ve CD8 coreceptors, ifade öz-peptit/MHC ZPT Tarih ile meşgul. Timositleri ile kendi öz-peptit/MHC ligandlar ılımlı bir benzeşim tek pozitif (SP) CD4 veya CD8 timositleri, pozitif seçimi olarak adlandırılan bir süreç haline olgun. Diğer taraftan, aşırı TCR stimülasyon öz-peptit/MHCs aracılığıyla almak timositleri apoptosis yolu ile negatif seçim3,4tabi. Stimülasyon kaynaklı, caspase bağımlı apoptosis bu işlemi taklit vitro anti-CD3/28 antikor kaplı boncuk5ile örneğin timositleri uyararak olabilir. Seçim süreci geçmek olgun T hücreleri tarafından sigara-öz-peptit/MHC ligandlar ZPT çevre üzerinden aktif hale gelir. Öz-peptit/MHCs hala hayatta kalma ve homeostatik yayılması, yardımcı T hücreleri farklılaşma ve sigara-öz-peptit/MHCs T hücreli yanıt geliştirme için sinyal tonik bağlamında Periferik T hücre ilgilidir coagonism6,7,8,9. Yüksek-benzeşme TCR bağlama peptit/MHC ligand için ağ10sinyal bir karmaşık TCR oluşturan birçok sinyal molekülleri içeren birkaç aşağı akım sinyal yollar etkinleştirir. TCR sinyal yollar birkaç on yıl için inceledik ve henüz yolun yeni arabulucu keşfi11,12azalmaya hiçbir iz gösterir. TCR sinyal yolları modülasyon klinik ilgisi vardır ve T hücreli yanıt için immunotherapeutic uygulamaları ya da T-hücre yanıt otoimmünite13kontrolünü için inhibisyonu potentiating içerebilir. T-hücre yanıt modülasyon için stratejiler esas olarak faaliyet14,15,16kinaz veya fosfataz bozulma bağlıdır.
Akış Sitometresi-tabanlı bir tahlil küçük kimyasal bileşikler ile taranması için bir uygulama yeteneklerini TCR sinyal ve T-hücre harekete geçirmek17modüle için açıklar. Tahlil için güçlü TCR sinyaller maruz kaldığında apoptosis yolu aktive timositleri olgusu bağlı. Tahlil stimülasyon gücü değişiklikleri tanımlamak için yeterince duyarlıdır; transgenik TCR benzeşme artan peptit/MHC tetramers ile ifade timositleri kuluçka caspase harekete geçirmek-apoptotik yanıt5bir ölçüsü olarak kullanılan karşılık gelen bir artış sonuçlandı. Belgili tanımlık perde için kinaz inhibitörleri içeren bir kitaplık kullanılan ve güçlü TCR sinyalleri thymocyte cevaben modüle yeteneğini değerlendirildi.
Çeşitli akış sitometresi-tabanlı veya floresan muhabir dayalı stratejiler bir ürün yelpazesine periferik harekete geçirmek fenotipleri çeşitli T-hücre alt kümeleri içinde yüksek-den geçerek taranması için tarif edilmistir. Bu tür stratejiler içerir bir okuma sitotoksik T hücre etkinlik19,20ve analizi olarak degranulation kullanımı, genetik floresan gazeteciler zamanlama ve T-hücre harekete geçirmek18büyüklüğü değerlendirmek için kullanımı fosforilasyon çeşitli proteinlerin hücresel21sinyal dahil.
Burada sunulan tarama tahlil başarıyla yolu yanı sıra potansiyel, yeni bileşikler TCR sinyal üzerinde inhibitör etkisi ile sinyal TCR kanonik molekülleri inhibe bileşikler tanımlamak yapabiliyor. Örneğin, GSK3β ve Hsp90 inhibitörleri T hücreli yanıt-e doğru17etkileyen yeni bileşikler tespit edilmiştir. Tahlil apoptotik yanıttan TCR bağımsız inhibitörlerinin etkileri hücresel toksisite bir azalma nedeniyle sinyal iletimi müdahale inhibitörleri ayırt edebilmektedir. Apoptozis indüksiyon ek olarak, ayrıca CD69 upregulation ve TCR downregülasyon harekete geçirmek imleyicileri ölçüyoruz. Ağlar karmaşıktır sinyal TCR birden çok güzel kullanımı molekülleri ile tek bir yol üzerinde belirli etkileri keşfetme şansını artırabilir. Burada, aynı zamanda akış sitometrik çözümlemesi için hazırlık hücrelerde boyama sırasında Santrifüjü bağımsız Protokolü kullanmaya özgün iletişim kuralını yüksek üretilen iş alternatif olarak tanıtmak. Bu raporda açıklanan tahlil kinaz inhibitörleri içeren küçük bir bileşik kitaplık kullanır ama prensip olarak, bu daha yüksek üretilen iş tarama için kullanılabilir. Seçim Kütüphanesi Ayrıca inhibitörleri ya da diğer molekülleri çeşitli dahil.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada önerilen tarama strateji timositleri apoptotik etkileri stimülasyon, T-hücre harekete geçirmek-CD69 upregulation ve TCR downregülasyon daha geleneksel işaretleri yanı sıra sonra bastırmak için küçük molekül inhibitörleri yeteneğini değerlendirir . Ek işaretleri farklı thymocyte alt kümeleri32analizini etkinleştirmek için de. TCR sinyal engel inhibitörleri de daha fazla ayrım inhibitörleri hücre ölümü inducing olabilir TCR bağımsız etkileri vurgulayarak apoptosis, indüksiyon nemlendirin geçerli testin ilginç bir yönü yatıyor. Ayrıca, bir akış sitometresi-tabanlı tahlil inhibitörlerinin etkileri TCR sinyal, ayrı bireysel dallarda rapor olabilir farklı harekete geçirmek işaretleyici olarak birden çok güzel kullanımı sağlar. Burada sunulan durumda caspase-3 harekete geçirmek ve CD69 upregulation fark inhibisyonu gösterdi inhibitörleri vardı. Çünkü bazı bileşikler protein sentezi veya veziküler kaçakçılığı gibi temizlik işlevleri etkileyebilir, bu etkileri upregulation sentez de novo işaretleri (Örneğin, CD69) ama üzerinde ardından gözlemlemek için şaşırtıcı değil değişiklikler (Örneğin, caspase-3 proteolitik aktivasyonu).
Sunulan tahlil olarak burada apoptosis ölçer bir okuma bu inhibitörleri gizli toksik etkileri sonuçları belirsiz değil zorunludur. Örneğin, ekranda, biz staurosporine 1 ötesinde seyreltik değil nM, hâlâ o konsantrasyonu, hücrelere toksik varlık rağmen. Önüne gelenle yatıp kalkan kinaz inhibitörü ve bir uyarıcı apoptosis33olmak staurosporine ile anlaşma temsilcisi sonuçlarıdır. Yeterli seyreltme için toksik olmayan konsantrasyonları test bileşikler potansiyel sayısı gözden kaçırmak mümkündür.
Burada ayrıntılı tarama strateji timositleri yüksek üretilen iş tarama için yeterli sayıda elde etme ile ilgili komplikasyonlar nedeniyle insanlar uygulamak zor olacaktır. Ancak, Pediatrik kardiyak biyopsi34,35 veya fetusa36,37insan timus örnekleri edinmek mümkündür. Yine de, yollar ve sinyal Proteinler amino asit dizileri büyük ölçüde fareler ve insanlar arasında korunmuş TCR sinyal olarak thymocyte tahlil yararlı ön elemeyi strateji sağlar ve fare kullanarak bu tahlil ile herhangi bir sonuç elde timositleri sonra birincil insan lenfosit doğrulanabilir.
Geleneksel Santrifüjü bağlı iletişim kuralı bir sınırlama hücre permeabilization ve Santrifüjü gibi adımları içerir süreç multistep doğası atfedilen hücre kaybı olasılığı ile ilgilidir. Her Santrifüjü hem de resuspension adım hücrelerinin kaybı kaçınılmaz olur. Böyle kayıplar sınırlı sayıda örnekleri içeren çalışmalar için kritik olmayabilir iken, akışı sağlayarak daha yüksek tarama özellikle ilerledikçe tahlil biçimi 96-384 – için 1536-iyi uygulandığında sorunlar doğuracak. Bu sorunu aşmak için bir hücre permeabilization ve birden çok yıkar5komplikasyonları kaçınırken caspase harekete geçirmek algılanabilmesi hücre geçirgen floresan caspase sensörleri38 aracılığıyla yoludur. Alternatif olarak, istihdam, laminer akış tarafından hücreleri Yıkama Santrifüjü bağımsız bir yöntem hücre kaybı en aza indirmek için olanağı da sağlar. Bir duvar daha az plaka ile birlikte İstasyonu yıkama bir otomatik plaka ile hücreleri laminar akış bir santrifüj kullanımı olmadan tarafından yıkanır. Reaktifler üstel seyreltme kapsamlı ve verimli az 3 santrifüj çamaşır iki tur için eşdeğer bir seyreltme temsil eden dk, hücrelerinin durulama için sağlar. Dış gerilmeler Santrifüjü nedeniyle olmadan hücreleri daha uygun ve hücre kayıpları en aza indirilir.
Timositleri 96-şey U-alt kültür sonra İstasyonu yıkama otomatik plaka kullanma imkanı da keşfettik plakaları ve ayrıca, hücreleri doğrudan duvar daha az plakaları İstasyonu yıkama otomatik plaka ile uyumlu kültür. Duvar-az plakaları hücre kültürü çalışmalarının tüm aralıklarla merdiven ortadan kaldırılması etkin ve plakalar arasında bir örnek transfer gereksinimini ortadan kaldırarak hücre kaybı en aza indirilmiştir. Genel olarak, üç farklı protokoller stimülasyon etkinlik ve boyama içinde karşılaştırılabilir. Otomatik yıkama istasyonu Otomasyonu, hız ve verimlilik, yüksek üretilen iş analizi kolaylaştırır yararı sağlar. Ayrıca, artan Otomasyon ile çamaşır adımları daha hızlı yapılabilir ve deneyler veya Denemecileri arasında büyük bir tutarlılık olduğunu. Ancak, yıkama istasyonu bazı dezavantajları vardır:, arabellekleri yıkama geniş hacimli gereklidir priming çamaşır makinesi için hangi 50 mL yıkamak için kullanılan arabellek değişikliği, ücret (150 mL); ekstra bakım plaka işleme herhangi bir çapraz bulaşma sınırlı küçük hacimli plaka kuyular arasında bölümleme nedeniyle Wells önlemek için gerekli olduğu; Çamaşır daha yüksek bir hazır reaktifler kullanımı gerektirir sonra Wells 25 µL kalan arabellek 1 x konsantrasyon daha. Kalan cilt sorunları ve sınırlı birim kapasitesi plaka adrese, 70 µL kuluçka birimden 150 µL için genişletmek için suç ortağı, geleneksel iletişim kuralları kabulü kolaylaştırıcı eklenebilir. Otomatik Plaka işleme sistemleri şu anda mevcut olmakla birlikte, onlar ~ 1 kübik ayak (~0.028 m3) küçük birimidir laminer yıkama sistemi için karşılaştırıldığında önemli bir ayak izi var. Ayrıca, aralıklarla otomatik plaka işleme sistemlerini tümleştirme hücre çamaşır onların kullanımda sınırlama meydan okuyor. Şu an bildiğimiz gibi aletler kullanılabilir, yıkama yok santrifüj bağımsız hücre bulunmaktadır.
Burada sunulan tarama strateji küçük moleküller ve TCR sinyal ve T Hücre aktivasyonu etkileyen onların sözde hedef kinaz tanımlamak yapabiliyor. Burada kullanılan kitaplık kinaz inhibitörleri küçük molekül ağırlıklı oluşur ve potansiyel sayısı ilginç bir dizi elde edebilecektir. İletişim kuralı da kolayca inhibitörü kitaplıklarına diğer enzim sınıfları veya küçük moleküller diğer türleri için hem de diğer bileşikler (Örneğin, çeşitli oluştururlar) kitaplıklara uygulanır. İletişim kuralı ekran Periferik T lenfositler veya transgenik TCRs ifade veya muhabir sistemleri taşıyan dahil olmak üzere ölümsüzleştirdi hücreleri gibi diğer hücre tipleri için kullanılabilir. Belirlenmesi ve T-hücre sinyal yolu ile ilgili bilgilerimizi artırmak ve aynı zamanda hedefe yönelik tedavi immün hastalıklar13,14,15, , geliştirilmesinde yardım sinyali yeni arabulucu karakterize 16. tüm, bu çalışmada T-hücre sinyal yolu ile yüksek-den geçerek tarama deneyleri arabulucu tespiti için kullanılabilir seçenekler aralığına ekler.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe Singapur Sağlık Bakanlığı’nın Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi, NMRC CBRG15may017 ve Singapur Eğitim Bakanlığı, 2014-T2-1-136 (N.R.J.G.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| RPMI | HyClone | SH30027FS | |
| FBS | HyClone | SH3007103 | |
| L-Glutamine | HyClone | SH3003401 | |
| Sodium pyruvate | HyClone | SH3023901 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 516732 | |
| 10X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
| Kinase Screening Library (96-Well) | Cayman Chemical | 10505 | Exact contents of the library may vary |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| anti-CD3/CD28 beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | |
| FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit | BD Pharmingen | 550480 | Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody |
| DA-Cell Washer | CURIOX | HT1000 | |
| 96-well DA-Cell Plate | CURIOX | 96-DC-CL-05 | |
| Antibodies | |||
| CD3e | BioLegend | 100236 | |
| TCRb | BD Biosciences | 553174 | |
| CD4 | BD Biosciences | 740007 | |
| CD8 | BD Biosciences | 563786 | |
| CD69 | eBioscience | 25-0699-42 | |
| Inhibitors | |||
| TG003 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PKC 412 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Doramapimod | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Paclitaxel | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erlotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-5 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-BEZ235 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Phthalazinone pyrazole | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-879 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 1-NA-PP1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Torin 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide II | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIBF 1120 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SMI-4a | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10657 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-703026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Chelerythrine chloride | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Tunicamycin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| GSK 1059615 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Ruxolitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 505124 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| INK128 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Canertinib (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 431542 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 173074 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Valproic Acid (sodium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 0325901 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| VX-702 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Emodin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIO | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Imatinib (mesylate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sunitinib Malate | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Gefitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 3-Methyladenine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide I | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide IV | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide V | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 663284 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D 4476 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NU 7026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-9 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Indirubin-3'-monoxime | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-62 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-93 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CGP 57380 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Iso-Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide VIII (acetate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ST638 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6656 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY364947 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10621 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| YM-201636 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 447439 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-041164 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-AEW541 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP242 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ABT-869 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10622 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 17β-hydroxy Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10626 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6668 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10572 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| N,N-Dimethylsphingosine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY294002 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| U-0126 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Staurosporine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-92 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 (potassium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| O-1918 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 98059 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 169316 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TGX-221 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D-erythro-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| OSU03012 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| JNJ-10198409 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Arachidonic Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lauric Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-252424 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10505 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI-103 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PIK-75 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sphingosine Kinase Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Piceatannol | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (R)-Roscovitine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BAY-43-9006 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10561 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-604850 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI3-Kinase α Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ML-9 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Triciribine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erbstatin Analog | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Kenpaullone | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-494 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-825 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1478 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 216763 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 415286 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-17 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-8 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LFM-A13 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-514 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Apigenin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10554 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| DRB | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-13022 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-14620 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-490 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-82 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-99 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-213 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-183 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lavendustin C | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 336372 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 5-Iodotubercidin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 202190 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10571 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Nilotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SP 600125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| L-threo-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-89 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| HA-1077 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-370 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1296 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KT 5823 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Janex 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10574 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10575 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10576 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NH125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TWS119 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 210902 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10577 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10578 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 184161 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CCT018159 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Myricetin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
References
- Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
- Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
- Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
- Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
- Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
- Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
- Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
- Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
- Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
- Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
- Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
- Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
- Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
- Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
- Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
- Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
- Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
- Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
- Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
- Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
- Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
- Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
- Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
- Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
- Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. . Novel compounds. , (2003).
- Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
- Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
- Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
- Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
- Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
- Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
- Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
- Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).
