Идентификация посредников Т-клеточных рецепторов сигналов через скрининг химического ингибитор библиотек
Summary
Этот документ использует на основе потока цитометрии пробирного экране библиотеки химических ингибиторов для идентификации ингибиторы и их целевых показателей, которые влияют на Т-клеточный рецептор сигнализации. Методы, описанные здесь также могут быть расширены для фильмов высокой пропускной способности.
Abstract
Т-клеточных рецепторов (TCR) сигнальный путь состоит из множества посредников, которые передают сигналы после активации TCR. Различные стратегии были предложены и осуществлены для идентификации новых посредников TCR сигнализации, которые способствовали бы улучшению понимания процессов Т-клеток, включая активацию и тимуса выбор. Мы описываем скрининг assay, который позволяет идентифицировать молекул, которые влияют TCR сигналов, основанный на активации развивающихся тимоцитов. TCR сильные сигналы вызывают развивающихся тимоцитов активировать механизм апоптоза в процесс, известный как негативный выбор. Путем применения ингибитора киназы те с целями, которые влияют на сигнализацию TCR способны переопределить процесс негативного отбора. Метод, подробно изложены в настоящем документе может использоваться для идентификации ингибиторы канонических киназ с установленными ролями в TCR сигнальных путей, а также ингибиторы новых киназ еще должен быть создан в сигнальных путей TCR. Стратегия отбора здесь может применяться к экранам более высокую пропускную способность для идентификации Роман druggable целей в TCR сигнализации.
Introduction
Т-клетки являются линии лимфоцитов, которые играют ключевую роль в поддержании адаптивного иммунитета. Они выражают TCR, что позволяет им признавать их лиганды, комплексы, состоящие из сложных молекул гистосовместимости (MHC) с привязанного пептид, которые встречаются на поверхности антиген представляющих клеток (БТР). Срабатывание сигнализации путь через взаимодействие TCR/MHC TCR имеет решающее значение для активации Т-клеток и развитию1.
В развитие Т-клеток кость-костного мозга производные гемопоэтических стволовых клеток (СКК) перенести тимуса, где они подвергаются дифференциации и пройти через этапы Т-клеточной линии прогрессии2. Двухместный позитивные (DP) тимоцитов, выражая CD4 и CD8 coreceptors, взаимодействовать с self пептида/MHC на БТРах. Тимоцитов с умеренным сродством для их самостоятельной пептида/MHC лигандов Зрелые стать сингл позитивные (SP) CD4 и CD8 тимоцитов, процесс называют как позитивного выбора. И наоборот тимоцитов, которые получают чрезмерной стимуляции TCR через self пептида/MHCs проходят apoptosis через негативный выбор3,4. Этот процесс апоптоза стимуляции индуцированного, caspase зависимая может быть передразнил в пробирке , стимулируя тимоцитов, например с бисером антителами anti-CD3/285. Зрелых Т-клеток, которые прошли процесс отбора активируются non-self пептида/MHC лигандов с БТР на периферии. Self пептида/MHCs по-прежнему актуальны для периферической Т-клеток, в контексте тоник, сигнализации для выживания и гомеостатических распространения, дифференциация вспомогательные Т-клеток и повышение Т-клеток ответов на non-self пептида/MHCs через coagonism6,,78,9. Высокоспецифичные связывающие TCR с пептида/MHC лигандом активирует несколько ниже по течению сигнальные пути, которые включают много сигнальных молекул, формирование комплекса TCR сигнализации сети10. TCR сигнальных путей были изучены на протяжении нескольких десятилетий, и тем не менее открытие новых посредников пути показывает никаких признаков ослабления11,12. Модуляция TCR сигнальных путей имеет клиническое значение и может включать потенцирования Т-клеточный ответ для иммунотерапевтических приложений или ингибирование Т-клеточный ответ для управления аутоиммунитета13. Стратегии для модуляции Т-клеток ответов главным образом зависят от нарушения киназу или фосфатазы деятельности14,,1516.
Мы описываем приложения на основе потока цитометрии анализа для проверки малых химических соединений для их способность модулировать TCR сигнализации и Т-клеток активации17. Assay петли на явлении тимоцитов, активизируя путь апоптоза при воздействии сильные сигналы TCR. Assay достаточно чувствительным для выявления изменений в стимуляции силой; инкубации тимоцитов, выражая трансгенных TCR с пептида/MHC тетрамера с увеличением сродство привело к соответствующему увеличению caspase активации используется как мера реакции apoptotic5. Для экрана мы использовали библиотеку ингибитора киназы и оценивать их способность модулировать тимоцитов ответ на сильные сигналы TCR.
Были описаны несколько потока цитометрии основанные или флуоресценции репортер стратегии для высокопроизводительного скрининга ассортимент периферийных активации фенотипы в различных подмножеств Т-клеток. Такие стратегии включают в себя использование генетических флуоресцентные репортеров для оценки сроков и масштабов Т-клеток активации18, использование дегрануляции как индикация19,активность цитотоксических Т-клеток20и анализ фосфорилирование различных белков, участвующих в сотовых сигнализации21.
Assay скрининга, представленные здесь возможность успешно идентифицировать соединений, которые тормозят канонические молекул TCR, сигнальный путь, а также потенциал, Роман соединений с тормозящее действие на TCR сигнализации. Например мы определили ингибиторов GSK3β и Hsp90 как новых соединений, влияющих на Т-клеточные ответы17. Assay возможность различать ингибиторов, которые мешают трансдукции сигнала, вследствие сокращения в ответе apoptotic, TCR-независимые эффекты ингибиторов на сотовой токсичности. В дополнение к индукции апоптоза мы также измерить CD69 upregulation и TCR Даунрегуляция как маркеры активации. Как TCR сигнализации есть сложных сетей использование нескольких показаний может увеличить шансы обнаружения молекул с конкретными последствиями на один путь. Здесь мы также внедрить использование центрифугирования независимый протокол как альтернатива высокой пропускной способностью для первоначального протокола во время окрашивания клеток в рамках подготовки анализа гранулярных потока. Assay, описанные в этой статье использует небольшую библиотеку составных ингибиторов протеинкиназы, но, в принципе, он может использоваться для более высокой пропускной способности скрининга. Библиотека выбора также может включать различные ингибиторы или других молекул.
Protocol
Representative Results
Discussion
Стратегия отбора предлагаемых здесь оценивается способность малых молекул ингибиторов для подавления apoptotic в тимоцитов после стимуляции, помимо обычных маркеров upregulation активации CD69 Т-клеток и TCR Даунрегуляция . Дополнительные маркеры также могут быть включены для включения анализа различных тимоцитов подмножеств32. Интересным аспектом текущего анализа заключается в том, что ингибиторы, которые препятствуют TCR сигнализации бы также ослабить индукции апоптоза, далее подчеркивая различие TCR-независимые эффекты ингибиторов может иметь на вызывающие гибель клеток. Кроме того на основе потока цитометрии пробирного позволяет использовать несколько показаний как собственный активации маркеры, которые могут сообщить эффекты ингибиторов на отдельных отдельных отраслей TCR сигнализации. В случае, представленные здесь были ингибиторов, которые показали дифференциального ингибирование активацию caspase-3 и CD69 upregulation. Потому что некоторые соединения могут повлиять на хозяйственные функции, такие как синтез белка или везикулярного людьми, это не удивительно наблюдать эффекты на upregulation de novo синтезированных маркеров (например, CD69), но не на Посттрансляционная изменения (например, протеолитических активацию caspase-3).
Как assay представленные здесь меры апоптоз как индикация, крайне важно, что скрытые токсические эффекты ингибиторов не заслонять результаты. Например, на экране, мы сделали не разбавить staurosporine за 1 Нм, несмотря на его по-прежнему токсичны для клеток при этом концентрации. Представитель результаты согласуются с staurosporine, неразборчивый киназы ингибитора и индуктором апоптоз33. Без достаточной разбавления протестированы на нетоксичные концентрации соединений можно упустить потенциальных хитов.
Стратегия отбора, подробно здесь будет трудно применять к людям из-за осложнений, связанных с получением достаточного количества тимоцитов для высокопроизводительного скрининга. Однако можно получить образцы человеческого тимуса от педиатрической сердечной биопсий34,35 или36,плодов37. Тем не менее, как TCR сигнальные пути и аминокислотных последовательностей сигнализации белки основном сохраняются между мышей и людей пробирного тимоцитов обеспечивает полезный предварительный скрининг стратегию, и любые результаты, полученные с этот assay, с помощью мыши тимоцитов может затем, проверена в первичной лимфоцитах человека.
Одним из ограничений обычного центрифугирования зависимых протокола относится к Перспектива потери клеток, которые можно отнести к многоступенчатый характер процесса, который включает такие шаги, как клетки permeabilization и центрифугирования. Каждый центрифугирования и ресуспендирования шаг неизбежно приводит к гибели клеток. Хотя такие потери не могут быть критически важное значение для исследований с участием ограниченного числа проб, он может породить проблемы при применении скрининг более высокой пропускной способности, в частности, по ходу пробирного формат из 96 – до 384-1536-хорошо. Одним из способов обхода этой проблемы является использование клеток проницаемой флуоресцентные caspase датчики38 , включите обнаружение активацию caspase избегая осложнений клеток permeabilization и нескольких стирок5. Кроме того используя метод центрифугирования независимые обмыв ламинарные клетки также возможна для минимизации ячейка потерь. С автоматизированной пластиной промывочной станции в сочетании с табличкой стены менее клетки омываются ламинарного потока без использования центрифуг. Экспоненциальная разбавления реагентов позволяет для тщательной и эффективной промывки клеток в менее чем 3 мин, которая представляет собой эквивалент разбавления до двух раундов центробежные стирки. Без внешних напряжений вследствие центрифугирования клетки более жизнеспособны и клеток потери сведены к минимуму.
Мы также изучили возможность использования автоматизированных пластины, промывочная станция после культивирования тимоцитов в 96-Ну U-нижней пластины и, Кроме того, культивирование клеток прямо в стену менее пластины совместим с автоматизированной пластины, промывочная станция. Культивирования клеток в стене менее пластины включен ликвидации всех шагов центрифугирования и свести к минимуму потери клеток, устраняя необходимость передачи образца через пластины. Как правило три различные протоколы являются сопоставимыми в эффективность стимуляции и пятнать. Станция автоматической мойки обеспечивает преимущество автоматизации, скорость и эффективность, что делает его легче для анализа более высокой пропускной способности. Кроме того с большей автоматизации, Стиральная шаги может осуществляться быстрее, и есть большей согласованности между экспериментов или экспериментаторов. Однако, станция мойки имеет определенные недостатки: большими объемами отмывающего буфера требуются для грунтования шайбу (150 мл в буфер изменения, из которых 50 мл используется для стирки); осторожность необходима при обработке пластину избежать любого загрязнения скважин из-за ограниченного перегородки между скважинами малообъемной плиты; остаточные буфер 25 мкл в скважинах после стирки требует использования реагентов, подготовленных на более высоком чем 1 x концентрации. Для решения проблемы остаточного объема и ограниченный объем плиты, могут быть добавлены аксессуар расширить объем инкубации из 70 мкл до 150 мкл, содействия принятию обычных протоколов. Хотя в настоящее время имеются системы обработки автоматизированной пластины, они имеют значительный след, по сравнению с ламинарным мыть системы, которая представляет собой небольшое устройство ~ 1 кубический фут (~0.028 м3). Кроме того интеграция центрифугирования в автоматизированных систем обработки пластина сложной, ограничивая их использования в ячейке стиральная. Есть в настоящее время нет центрифуги независимые ячейки, мытья инструментов, насколько мы знаем.
Стратегия отбора, представленные здесь может определить малых молекул и их предполагаемой целевой киназы, которые влияют на TCR сигнализации и активация Т-клеток. Библиотека, используемая здесь состоит главным образом малых молекул ингибиторов киназ и был в состоянии генерировать ряд потенциально интересные ответы. Протокол можно также легко применять ингибитор библиотек из других классов ферментов или других типов малых молекул, а также библиотеки других соединений (например, различные макромолекул). Протокол может также использоваться для других типов клеток, например периферической Т-лимфоцитов или увековечен клеток, включая те, выражая transgenic TCRs или ношение репортер систем. Выявления и классификации новых посредников Т-клеточной сигнализации может улучшить наши знания о сигнальный путь, а также помощь в разработке целенаправленной терапии иммунных заболеваний13,14,15, 16. в целом, это исследование добавляет диапазон доступных вариантов Т-клеточных сигналов через высокопроизводительного скрининга анализов для выявления посредников.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана от грантов от министерства здравоохранения Сингапура Национальный медицинский исследовательский совет, NMRC CBRG15may017 и Сингапуре Министерство просвещения, 2014-T2-1-136 (N.R.J.G.).
Materials
| RPMI | HyClone | SH30027FS | |
| FBS | HyClone | SH3007103 | |
| L-Glutamine | HyClone | SH3003401 | |
| Sodium pyruvate | HyClone | SH3023901 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 516732 | |
| 10X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
| Kinase Screening Library (96-Well) | Cayman Chemical | 10505 | Exact contents of the library may vary |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| anti-CD3/CD28 beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | |
| FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit | BD Pharmingen | 550480 | Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody |
| DA-Cell Washer | CURIOX | HT1000 | |
| 96-well DA-Cell Plate | CURIOX | 96-DC-CL-05 | |
| Antibodies | |||
| CD3e | BioLegend | 100236 | |
| TCRb | BD Biosciences | 553174 | |
| CD4 | BD Biosciences | 740007 | |
| CD8 | BD Biosciences | 563786 | |
| CD69 | eBioscience | 25-0699-42 | |
| Inhibitors | |||
| TG003 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PKC 412 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Doramapimod | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Paclitaxel | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erlotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-5 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-BEZ235 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Phthalazinone pyrazole | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-879 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 1-NA-PP1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Torin 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide II | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIBF 1120 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SMI-4a | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10657 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-703026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Chelerythrine chloride | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Tunicamycin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| GSK 1059615 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Ruxolitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 505124 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| INK128 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Canertinib (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 431542 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 173074 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Valproic Acid (sodium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 0325901 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| VX-702 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Emodin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIO | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Imatinib (mesylate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sunitinib Malate | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Gefitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 3-Methyladenine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide I | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide IV | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide V | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 663284 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D 4476 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NU 7026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-9 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Indirubin-3'-monoxime | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-62 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-93 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CGP 57380 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Iso-Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide VIII (acetate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ST638 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6656 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY364947 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10621 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| YM-201636 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 447439 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-041164 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-AEW541 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP242 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ABT-869 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10622 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 17β-hydroxy Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10626 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6668 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10572 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| N,N-Dimethylsphingosine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY294002 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| U-0126 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Staurosporine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-92 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 (potassium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| O-1918 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 98059 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 169316 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TGX-221 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D-erythro-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| OSU03012 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| JNJ-10198409 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Arachidonic Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lauric Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-252424 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10505 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI-103 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PIK-75 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sphingosine Kinase Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Piceatannol | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (R)-Roscovitine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BAY-43-9006 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10561 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-604850 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI3-Kinase α Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ML-9 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Triciribine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erbstatin Analog | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Kenpaullone | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-494 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-825 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1478 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 216763 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 415286 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-17 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-8 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LFM-A13 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-514 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Apigenin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10554 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| DRB | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-13022 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-14620 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-490 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-82 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-99 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-213 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-183 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lavendustin C | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 336372 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 5-Iodotubercidin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 202190 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10571 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Nilotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SP 600125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| L-threo-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-89 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| HA-1077 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-370 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1296 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KT 5823 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Janex 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10574 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10575 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10576 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NH125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TWS119 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 210902 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10577 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10578 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 184161 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CCT018159 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Myricetin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
References
- Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
- Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
- Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
- Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
- Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
- Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
- Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
- Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
- Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
- Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
- Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
- Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
- Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
- Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
- Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
- Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
- Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
- Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
- Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
- Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
- Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
- Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
- Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
- Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
- Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. . Novel compounds. , (2003).
- Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
- Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
- Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
- Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
- Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
- Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
- Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
- Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).
