זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות
Summary
נייר זה משתמש assay המבוססות על זרימת-cytometry לספריות מסך של מעכבי כימיים לצורך זיהוי מעכבי ו המטרות שלהם להשפיע על איתות לקולטן T-cell. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות כאן גם עבור הקרנות תפוקה גבוהה.
Abstract
הקולטן T-cell (TCR) איתות לשביל כוללת שפע של מגשרים המעבירים אותות על הפעלת TCR. יש כבר הציע, מיושמת לצורך זיהוי מתווכים חדשים של TCR איתות, אשר היה לשפר את ההבנה של התהליכים T-cell, כולל הפעלה ובחירת הרתי אסטרטגיות שונות. אנו מתארים וזמינותו של ההקרנה המאפשרת הזיהוי של מולקולות המשפיעים TCR איתות בהתבסס על ההפעלה של פיתוח thymocytes. אותות TCR חזקה לגרום thymocytes המתפתח להפעלת מכונות אפופטוטיים להיפגע בתהליך המכונה הבחירה שלילי. באמצעות היישום של מעכבי קינאז, אלה עם מטרות המשפיעות TCR איתות מסוגלים לעקוף את התהליך של בחירת שלילי. השיטה מפורט במאמר זה יכול לשמש כדי לזהות מעכבים של kinases הקנוני עם תפקידים הוקמה ב המסלולים איתות TCR וגם מעכבים של kinases החדש עדיין כדי שהוקם המסלולים איתות TCR. ניתן להחיל את ההקרנה האסטרטגיה כאן למסכים של תפוקה גבוהה יותר לצורך זיהוי מטרות druggable הרומן TCR איתות.
Introduction
תאי T הם שושלת של לימפוציטים לשחק תפקיד מרכזי קיום החסינות מסתגלת. הם מבטאים TCR, המאפשרת להם לזהות ליגנדים שלהם, מתחמי המורכב של מולקולה מורכבת histocompatibility הגדולות (MHC) עם פפטיד מאוגד, אשר נמצאים על פני השטח של אנטיגן תאים (נגמ שים). מפעילה של TCR איתות באמצעות האינטראקציה TCR/MHC חיוני להפעלת תא T ופיתוח1.
בפיתוח T-cell, עצם מח-נגזר hematopoietic תאי גזע (HSCs) העברת התימוס, שבו הם עוברים התמיינות, לעבור את השלבים של T-cell שושלת היוחסין התקדמות2. Thymocytes (DP) כפול-חיובית, לבטא coreceptors CD4 והן CD8, לעסוק עם עצמי-פפטיד/MHC על נגמ שים. Thymocytes עם משיכה מתון על ליגנדים העצמי-פפטיד/MHC שלהם בוגרת כדי להפוך thymocytes (SP) CD4 או CD8 יחיד-חיובית, תהליך הנקרא כבחירה חיובי. לעומת זאת, thymocytes מקבל גירוי מוגזם TCR דרך העצמי-פפטיד/MHCs עוברים אפופטוזיס באמצעות בחירה שלילי3,4. תהליך זה של אפופטוזיס הנוצרות על-ידי גירוי, תלויי-קספאז ניתן חיקה במבחנה על ידי גירוי thymocytes, לדוגמה עם חרוזים מצופים נוגדן anti-CD3/285. בוגרת תאי T עוברים תהליך הבחירה מופעלים על ידי ליגנדים הלא-העצמי-פפטיד/MHC של נגמ שים בפריפריה. העצמי-פפטיד/MHCs עדיין רלוונטיות עבור היקפיים בתאי T, בהקשר של טוניק איתות הישרדות, התפשטות homeostatic, את הבידול של תאי T helper של השיפור של T-cell התגובות הלא-העצמי-פפטיד/MHCs דרך coagonism6,7,8,9. גבוהה-זיקה TCR קשירה ליגנד פפטיד/MHC מפעילה מספר מסלולים איתות במורד הזרם, בהם מעורבים הרבה מולקולות איתות ויוצרים של TCR מורכבים איתות רשת10. המסלולים איתות TCR נחקרו במשך כמה עשורים, אך הגילוי של מגשרים חדשים של מסלול מלמד אין האטה11,12. יכול לכלול שמגדיל יכולתו T-cell תגובות עבור יישומים immunotherapeutic או עיכוב של T-cell תגובות עבור הפקד של מחלת חיסון עצמי13, ויש הרלוונטיות הקלינית האפנון של TCR איתות המסלולים. אסטרטגיות האפנון של T-cell תגובות תלויים בעיקר על שיבוש קינאז או פוספטאז פעילות14,15,16.
אנו מתארים יישום של assay המבוססות על זרימת-cytometry להקרנה של תרכובות כימיות קטנות יכולתם לווסת TCR איתות ו T-cell הפעלה17. וזמינותו נשענות על התופעה של thymocytes הפעלת מסלול אפופטוזיס כאשר הם נחשפים אותות TCR חזקה. וזמינותו הוא רגיש מספיק כדי לזהות שינויים גירוי כוח; המקננת thymocytes לבטא הטרנסגניים TCR עם פפטיד/MHC tetramers עם הגדלת זיקה הביא וגידול מקביל קספאז ההפעלה המשמשות כמדד של התגובה מוות5. עבור המסך, אנו בשימוש ספריה של מעכבי קינאז, העריך יכולתם לווסת את התגובה thymocyte לאותות TCR חזקה.
מספר אסטרטגיות המבוססות על זרימת-cytometry או זריחה-כתב מבוססי תוארו להקרנה תפוקה גבוהה של מגוון פנוטיפים ההפעלה היקפיים של קבוצות משנה T-cell שונים. אסטרטגיות כאלה כוללות שימוש כתבים פלורסנט גנטית כדי להעריך את התזמון ואת סדר הגודל של T-cell הפעלה18, השימוש degranulation של readout ציטוטוקסיות T-cell פעילות19,20, וכן הניתוח של זרחון של חלבונים שונים המעורבים הסלולר איתות21.
וזמינותו ההקרנה המובאת כאן היא בהצלחה לזהות תרכובות המעכבות מולקולות הקנוני של TCR איתות לשביל, וכן תרכובות פוטנציאל, הרומן עם מעכבות ההשפעות על TCR איתות. לדוגמה, אנחנו מזוהות מעכבי GSK3β ו Hsp90 תרכובות חדשות המשפיעים על T-cell תגובות17. וזמינותו הוא מסוגל להבחין את מעכבי להפריע אותות, עקב ירידה בתגובה אפופטוטיים להיפגע, מהשפעות TCR שאינו תלוי מעכבי על רעילות הסלולר. בנוסף אינדוקציה של אפופטוזיס, אנחנו גם למדוד קולטנים upregulation CD69 ו- TCR downregulation כסמנים של הפעלה. כמו TCR איתות רשתות מורכבות, השימוש מרובות הקריאות הבאות יכול להגדיל את הסיכוי של גילוי מולקולות עם השפעות ספציפיות על מסלול יחיד. כאן, אנחנו מוסיפים גם השימוש של פרוטוקול שאינו תלוי-צנטריפוגה כחלופה תפוקה גבוהה הפרוטוקול המקורי במהלך ההכתמה של התאים לקראת הניתוח cytometric זרימה. וזמינותו המתוארים במאמר זה משתמש בספריית מתחם קטן של מעכבי קינאז, אבל, באופן עקרוני, ניתן להשתמש להקרנה תפוקה גבוהה יותר. הספריה של הבחירה ניתן גם לשלב מגוון רחב של מעכבי או מולקולות אחרות.
Protocol
במחקר זה, שימשו 6 עד 8-בת זכר ונקבה עכברים C57Bl/6. העכברים התרבית במתקן בעלי חיים באוניברסיטה הלאומית של סינגפור (סינגפור). טיפול בבעלי חיים מוסדי באוניברסיטה הלאומית של סינגפור ועל שימוש הוועדה (IACUC) אישר כל ניסויים בבעלי חיים. 1. הכנת Thymocyte השעיה המתת חסד העכברים בחדר2 CO. בצע את השלבים הבאים בשכונה תרביות רקמה כדי למנוע כל זיהום של התרבויות תא. לאבטח את הגווייה העכבר ללוח לנתיחה, באמצעות סיכות, לרסס את העכבר עם 70% אתנול. בעזרת זוג מספריים, עושים חתך אנכי בצד הגחוני, החל מהבטן לעבר הלסת. לעשות עוד יותר חתכים לאורך כל אחת הרגליים האחוריות. למתוח את העור כדי לחשוף את כלוב הצלעות ותגיד לי במדויק. לחתוך על הסרעפת ועל צידי הצלעות מהקצה האחורי עם זוג מספריים. הרם את כלוב הצלעות, להצמיד אותו למטה וחושפים בלוטת התימוס. להפריד את רקמות החיבור המצורפת התימוס ולחלץ התימוס באמצעות זוג מלקחיים מעוקל. למקם את בלוטת התימוס טוב של צלחת 6-ובכן המכיל 5 מ של מדיה RPMI מלאה.הערה: שקול להוסיף 10% הפשיטו פחם עוברית שור סרום (FBS) בכלי התקשורת כדי לשפר את הכדאיות thymocyte אם הרבה זמן ההמתנה צפויה בין הקרע ואת וזמינותו גירוי. בעדינות מועכים התימוס, באמצעות הצד הקהה של מזרק, ולהעביר את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. לחלופין, כדי לאסוף thymocytes במצב בריא יותר, שקול להשתמש שני זוגות של מלקחיים כדי לסחוט התימוס ולאסוף את thymocytes הזרימה מחוץ האפיתל הרתי. המשך לתא ספירה, באמצעות hemocytometer או על תא כלשהו אוטומטיות ספירת כלי. 2. טיטור של מעכבי קינאז ריכוזי רעילים הערה: סעיף זה מתמקד הכנת את מעכבי שימוש במסכים הפעלה T-cell. מעכבי שימוש בריכוזים גבוהים יכולה לגרום מוות של תאים, אשר הוא readout מסכי הפעלה T-cell. סדרת דילולים המטרות מעכבי כדי לקבוע את הריכוז הסופי של מעכבי בודדים זה לא אמורות לגרום אפופטוזיס עצמאית של גירוי TCR. הספריה של מעכבי קינאז השתמשו במחקר זה נרכש של ספק חיצוני. הרשימה של מעכבי נכללת טבלה של חומרים. הכנת לוחות של מעכבי קינאז בריכוזים נמוכים להכין צלחת של מעכבי-1 מ מ, להוסיף 10 µL של מעכבי µL 90 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) עבור כל המעכבים.הערה: מעכבי מהספריה מולקולה קטנה השתמשו במחקר זה לבוא ריכוז מניות של 10 מ מ. אם מעכבי בצורת גלולה, בצע את הפעולות המומלצות להתחדשות ומבנה מן הספקים. אם מעכבי לא מסופקים ב- 10 מ מ, הכינו את הצלחות מעכב בריכוזים המתאימים חלופיים במקום והכן נפרד דילולים טורי של חולים עם גורם מתאים לדילול.אזהרה: במקרים של מעכבי רעילים, להישמע להוראות היצרן על טיפול בטוח, סילוק. להכין צלחת של מעכבי 0.1 מ”מ, להוסיף 10 µL של מעכבי הזהב של 1 מ מ מעכבי µL 90 של דימתיל סולפוקסיד. להכין צלחת של מעכבי-0.01 מ מ, להוסיף 10 µL של מעכבי הזהב של 0.1 מ”מ מעכבי µL 90 של דימתיל סולפוקסיד. טיפול thymocytes עם מעכבי קינאז להכין השעיה thymocyte כאמור בסעיף 1. לדלל thymocytes ב RPMI מלאה כדי לקבל השעיה thymocyte של 5 x 106 תאים/מ ל…. להוסיף 200 µL של השעיה thymocyte בארות כל צלחת 96-ובכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצי. על כל טוב, להוסיף 2 µL של מעכבי המתאימה היטב של צלחת המכיל מעכבי 1 מ מ (הריכוז הסופי של מעכבי הוא 10 מיקרומטר). בצלוחית אותו, להכין מארבע בארות של פקדים ללא טיפול, מארבע בארות של מיקרומטר 5 שטופלו דקסמתזון פקדים חיובית, מארבע בארות של רכב שטופל פקדים שלילי, על-ידי הוספת 2 µL של דימתיל סולפוקסיד. דגירה של thymocytes c ° 37, 5% CO2 מגשים עבור 17-20 h (או לילה). קביעת ריכוז מתאים של מעכבי בודדים לסובב את הצלחת של thymocytes ב x 300 גרם , 4 מעלות צלזיוס, במשך 5 דק Resuspend תאי µL 250 FACS שטיפת המאגר. להפעיל ניתוח cytometric זרימה של הדגימות ולנתח את התוצאות עם תוכנית ניתוח cytometry זרימה. לקבוע את אחוז תאים חיים המבוסס על gating FSC-האס. האסטרטגיה המגביל מוצג איור 1B. חישוב ממוצע של האחוז של תאים חיים המבוסס על הפקדים שטופלו דימתיל סולפוקסיד, אשר הם מנורמל ב- 100%. להגדיר חלון שרירותי מקובל של מוות של תאים (e.g.,20%). מעכבי שתוצאתם אחוז של תאים חיים מתחת לחלון הזה (כלומר., מתחת 80% של הפקדים שטופלו דימתיל סולפוקסיד) הם להיבדק שוב בריכוזים נמוכים. מעכבי זה לא עבר את הקריטריונים הכדאיות בשלב 2.3.4, חזור על השלבים מצעדי 2.2.1 – 2.3.4, אך שימוש לצלחת של מעכבי 0.1 מ”מ עבור שלב 2.2.4 במקום לוח המכיל את מעכבי 1 מ מ. הריכוז הסופי של מעכבי המשמש כאן הוא 1 מיקרומטר. עבור מעכבי עדיין לייצר רמות גבוהות של מוות של תאים ב- 1 מיקרומטר, לבחון את מעכבי ב 0.1 מיקרומטר. חזור על שלבים 2.2.1 – 2.3.4, אך שימוש לצלחת של מעכבי-0.01 מ מ בשלב 2.2.4. הריכוז הסופי של מעכבי המשמש כאן הוא 0.1 מיקרומטר. הכנת צלחת מניות של מעכבי קינאז עבור מעכבי לשמש-10 מיקרומטר, להוסיף 10 µL של מעכבי 10 מ 10 µL של דימתיל סולפוקסיד. עבור מעכבי לשמש-1 מיקרומטר, להוסיף µL 1 של 10 מ מ מעכבי µL 19 של דימתיל סולפוקסיד. עבור מעכבי לשמש ב- 0.1 מיקרומטר, להוסיף 1 µL של מעכבי 10 מ מ 199 µL של דימתיל סולפוקסיד (איור 1C).הערה: הצלחת מניות מוכן של מעכבי הוא 500 x הריכוז של הריכוז הסופי מיועד כאשר הוסיף את המתלים thymocyte. ניתן להכין את הצלחת מניות של מעכבי ב- PCR רצועות או ב 96-ובכן צלחות. ניתן להחיל על thymocytes להקרנה הצלחת מניות של מעכבי קינאז מערכת צנטריפוגה תלוית קונבנציונאלי (סעיף 3; ראה איור 1A, שיטות 1 ו-2) או בכל מערכת עצמאית צנטריפוגה חלופית (סעיף 4; ראה איור 1A, שיטה 3). 3. קינאז מעכב ספריית ההקרנה (Assay מבוססי צנטריפוגה קונבנציונלי) טיפול thymocytes עם מעכבי קינאז להכין השעיה thymocyte כאמור בסעיף 1. לדלל thymocytes ב RPMI מלאה כדי לקבל השעיה thymocyte של 5 x 106 תאים/מ ל…. להוסיף 200 µL של thymocytes כל טוב של צלחת 96-ובכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצי. מניחים את הצלחת על קרח. להוסיף 0.5 µL של מעכבי לצלחת 96-ובכן מן הבארות המקביל של צלחת מניות המדכא מוכן בסעיף 2.4. להכין שמונה בארות של פקדים ללא טיפול. להכין מארבע בארות של פקדים רכב שטופל על-ידי הוספת 0.5 µL של דימתיל סולפוקסיד. להכין מארבע בארות של 5 מיקרומטר שטופלו דקסמתזון פקדים (איור 2). גירוי של thymocytes באמצעות אנטי-CD3/CD28 חרוזים קח 1 מ”ל של חרוזים, לשטוף את החרוזים עם 2 מ”ל ל- PBS. להפריד את החרוזים באמצעות עמדה מגנטי, וארוקן את הפתרון. Resuspend את החרוזים ב 5 מ של RPMI מלאה.הערה: היחס של חרוזים לתאים הוא 1-2.5. התאימו את כמות החרוזים לקחת, בהתאם את מספר בארות כדי לגרות את מספר thymocytes בשימוש. להוסיף 50 µL של חרוזים כל מדגם שטופלו מעכב, הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד ארבעה ארבעה מתוך שמונה דגימות ללא טיפול. להוסיף 50 µL של RPMI מלאה הבארות לא מטופל ארבעת הנותרים. איור 2 מציג את הפריסה הכללית של הצלחת. מערבבים את תכולת הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצי. דגירה של thymocytes c ° 37, 5% CO2 מגשים עבור 17-20 h (או לילה). צביעה של אנטיגנים משטח להכין תערובת מכתימים נוגדנים המכילים אנטי-TCRβ, אנטי-CD4, אנטי-CD8, נוגדנים אנטי-CD69. לדלל נוגדנים במאגר שטיפת FACS (PBS בתוספת 0.5% אלבומין שור [BSA]) ביחס של 1:200 (וי/v).הערה: שקול אופטימיזציה של נוגדן titers המשמש ההכתמה, במקום להשתמש נוגדנים קבוע דילולים, כדי למזער את הוריאציה מכתים לאורך ניסויים שונים וכדי לשפר את יחס אות לרעש. לסובב את הצלחת ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. קפיצי את הצלחת למחוק את הפתרון. בשלב זה, הפרוטוקול יכול לעקוב אחר הפרוטוקול צנטריפוגה תלוית קונבנציונאלי (להמשיך לצעוד 3.3.5; ראה איור 1A, שיטה 1) או פרוטוקול שאינו תלוי-צנטריפוגה חלופי (להמשיך לצעוד 4.4.4; ראה איור 1A, שיטת 2). Resuspend תאי µL 75 של תערובת נוגדן מכתימים מוכן בשלב 3.3.1. לערבב את הדגימות באמצעות פיפטה רב-ערוצי, דגירה אותם על קרח למשך 30 דקות. קיבוע תאים לשטוף את הבארות עם µL 200 FACS שטיפת מאגר ולסובב את הצלחת 300 x g ו- 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. קפיצי את הצלחת למחוק את הפתרון. להוסיף מאגר פיקסציה/permeabilization (מגיע עם ערכת אפופטוזיס קספאז-3 פעיל; אותו הדבר עם 10 x פרם/שטיפת מאגר שהוזכר בשלב 3.5.1, נוגדן anti-קספאז-3 בשלב 3.5.2) ב- µL 200 לכל טוב. דגירה על קרח למשך 30 דקות. תאיים צביעת עבור active קספאז 3 להכין מאגר פרם/שטיפת x 1 על ידי דילול 5 מיליליטר 10 מאגר פרם/שטיפת x ב- 45 מ של מים הנדסה גנטית. להכין את הכתם תאיים קספאז פעיל על-ידי הוספת 1.3 מ של נוגדן anti-קספאז-3 מ ל 6.5 1 x פרם/שטיפת מאגר. היחס של נוגדן פרם/לשטיפת מאגר הוא 1:5. לסובב את הצלחת ב x 300 גרם וחבוט 4 ° C, עבור 5 דק את הצלחת למחוק את הפתרון. לשטוף את הצלחת עם µL 200 1 x פרם/שטיפת המאגר. חזור על שלב 3.5.3. לסובב את הצלחת ב x 300 גרם וחבוט 4 ° C, עבור 5 דק את הצלחת למחוק את הפתרון. הוסף µL 75 של כתם קספאז תאיים המבושלות צעד 3.5.2 כל בארות. לערבב את הדגימות באמצעות פיפטה רב-ערוצי, דגירה על קרח לשעה. לשטוף את הדגימות עם µL 200 1 x פרם/שטיפת מאגר ולסובב את הצלחת ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. קפיצי את הצלחת למחוק את הפתרון. לשטוף את הצלחת עם µL 200 1 x פרם/שטיפת המאגר. לסובב את הצלחת ב x 300 גרם ו- 4 מעלות צלזיוס, למשך 5 דקות. קפיצי את הצלחת למחוק את הפתרון, resuspend את הדגימות ב 200 µL מאגר שטיפת FACS. להפעיל ניתוח cytometric זרימה של הדגימות ולנתח את התוצאות עם תוכנית ניתוח FACS. באמצעות מזימה נגד CD8 CD4, שער על האוכלוסייה של DP thymocytes עם ביטוי חיובי של CD4 ו- CD8 (איור 2, למטה חצי). בתוך השער thymocyte DP, לקבוע את אחוזי תאים עם מופעל קספאז-3, באמצעות המדגם unstimulated כמו בקרה שלילית של דקסאמתאזון של הפקד חיובי. לניתוח של הביטוי של CD69 בשער thymocyte DP, כדי להשתמש הדגימה unstimulated הפקד שלילי המדגם מאולצת של הפקד חיובי.הערה: כאשר gating על thymocytes העקורים, לוודא כי האוכלוסייה של DP thymocytes היא מגודרת כראוי לקבלת דוגמאות בודדות. Coreceptors משטח תאים מגורה downregulate, חרם לא מכוונות של אירועים יכול להתרחש אם שער DP חזק משמש. 4. קינאז מעכב ספריית ההקרנה (צנטריפוגה תלויית Assay) טיפול thymocytes עם מעכבי קינאז להכין השעיה thymocyte כאמור בסעיף 1. לדלל את thymocytes ב RPMI מלאה כדי לקבל השעיה thymocyte של 25 x 106 תאים/מ ל…. להוסיף 40 µL של thymocytes כל טוב של צלחת בנפח מצומצם, באמצעות פיפטה רב-ערוצי. מניחים את הצלחת על קרח. לדלל את מעכבי מן הצלחת מניות, דימתיל סולפוקסיד, דקסמתזון ב RPMI מלאה ביחס של ארבעת חלקי RPMI מלאה לחלק אחד של דימתיל סולפוקסיד/מעכב/דקסמתזון (גורם לדילול של 5).הערה: כמו אמצעי האחסון המשמשים את הצלחת בנפח מצומצם הזו הם 5 x יותר מאשר השיטה המקובלת, את מעכבי ו של ריאגנטים שליטה הן מדולל למטר לפני הוספתן ל thymocytes בצלחת. להוסיף 0.5 µL של מעכבי לצלחת 96-ובכן מן הבארות המקביל של צלחת המדכא מוכן בשלב 4.1.4. להכין שמונה בארות של פקדים ללא טיפול. להכין מארבע בארות של פקדים רכב שטופל על-ידי הוספת 0.5 µL של דימתיל סולפוקסיד מוכן בשלב 4.1.4. להכין מארבע בארות של 5 מיקרומטר שטופלו דקסמתזון פקדים, שימוש של דקסאמתאזון מדולל מוכן בשלב 4.1.4 (איור 2). גירוי של thymocytes באמצעות אנטי-CD3/CD28 חרוזים ודא כי החרוזים הם resuspended בצורה אחידה. קח 1 מ”ל של חרוזים ולשטוף אותם עם 2 מ”ל ל- PBS. להפריד את החרוזים באמצעות עמדה מגנטי, וארוקן את הפתרון. Resuspend את החרוזים של 1 מ”ל של RPMI מלאה.הערה: היחס של חרוזים לתאים הוא 1-2.5. התאימו את כמות חרוזים, בהתאם את מספר בארות כדי לגרות את מספר thymocytes בשימוש. להוסיף 10 µL של השעיה חרוז כל מדגם שטופלו מעכב, הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד ארבעה ארבעה מתוך שמונה דגימות ללא טיפול. להוסיף 10 µL של RPMI מלאה הבארות לא מטופל ארבעת הנותרים. איור 2 מציג את הפריסה צלחת כללי.הערה: הנפח הסופי של הבארות היא 50 µL, אשר נמצאים הקיבולת המרבית מן הבארות. חשוב לנקוט משנה זהירות, כדי להחזיק את הצלחות זקוף, כדי למנוע דליפה קרוס-. טוב. לערבב, להתסיס את הצלחת בעזרת מטרף מסלולית microplate. לחלופין, מערבבים את תוכן הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצי. דגירה של thymocytes c ° 37, 5% CO2 מגשים עבור 17-20 h (או לילה) עם מכסה אנטי-אידוי. התקנה של צלחת למכונת הכביסההערה: ההוראות להגדרת צלחת למכונת הכביסה הינם מסופקים על ידי היצרן. השלבים מוזכרים בקצרה להלן. בערך 150 מ ל פתרון נדרש עבור כל שלב לקרקע. ראש מערכת שטיפה עם אתנול 70% המכיל 1% Tween 20. ראש מערכת שטיפה עם מים יונים המכיל 1% Tween 20. ראש מערכת שטיפה עם מאגר שטיפת FACS. צביעה של אנטיגנים משטח להכין תערובת מכתימים נוגדנים המכילים אנטי-TCRβ, אנטי-CD4, אנטי-CD8, נוגדנים אנטי-CD69. לדלל את הנוגדנים במאגר שטיפת FACS ביחס של 1: 100 (v/v). לשטוף את הצלחת 9 x, באמצעות µL 55 FACS מאגר שטיפת לכל שטיפת, באמצעות זרימה שכבתית האוטומטי של שטיפת מערכת.הערה: בסוף מנקי, יהיו µL 25 נפח שיורית כל היטב. Resuspend תאי µL 25 של תערובת נוגדן מכתימים מוכן בשלב 4.4.1. אם הדגימות מועברים מצלחת 96-ובכן (מתוך שלב 3.3.4), resuspend תאי µL 50 של תערובת נוגדנים מוכנה בשלב 3.3.1, ולהעביר את הדגימות לצלחת בנפח מצומצם. שלב זה מקביל שיטה מס ‘ 2, כפי שהיא מתוארת איור 1A. לערבב, להתסיס את הצלחת עם מטרף מסלולית microplate או לערבב את הדגימות באמצעות פיפטה רב-ערוצי, דגירה על קרח למשך 30 דקות. קיבוע תאים לשטוף את הצלחת 9 x, באמצעות µL 55 FACS מאגר שטיפת לכל שטיפת, באמצעות זרימה שכבתית האוטומטי של שטיפת מערכת. להוסיף מאגר פיקסציה/permeabilization (מגיע עם ערכת אפופטוזיס קספאז-3 פעיל; אותו הדבר עם 10 x פרם/שטיפת מאגר שהוזכר בשלב 4.6.1 ונוגדן anti-קספאז-3 בשלב 4.6.2) ב- µL 50 לכל טוב. דגירה על קרח למשך 30 דקות. תאיים צביעת עבור active קספאז 3 להכין מאגר פרם/שטיפת x 1 על ידי דילול 25 מיליליטר 10 מאגר פרם/שטיפת x ב- 225 מ ל מים הנדסה גנטית. להכין את הכתם תאיים קספאז פעיל על-ידי הוספת 1 מ”ל של נוגדן anti-קספאז-3 מ ל 2 1 x פרם/שטיפת מאגר. היחס של נוגדן פרם/לשטיפת מאגר הוא 1:2. ראש מערכת שטיפה עם 1 x פרם/שטיפת מאגר. לשטוף את הצלחת 9 x 1 x מאגר פרם/לשטוף, ב- 55 µL עבור כל כביסה. להוסיף 25 µL של הכתם קספאז תאיים המבושלות צעד 4.6.2 כל בארות. לערבב, להתסיס את הצלחת עם מטרף מסלולית microplate או לערבב את הדגימות באמצעות פיפטה רב-ערוצי, דגירה על קרח לשעה. לשטוף את הצלחת 9 x 1 x מאגר פרם/לשטוף, ב- 55 µL עבור כל כביסה. להוסיף µL 25 FACS שטיפת מאגר כל בארות. העברת הדגימות microtiter צינורות לאחר נאותה ערבוב ויה pipetting. להוסיף עוד 50 µL FACS שטיפת מאגר הבארות ריקה, חזור על שלב 4.6.9. חזור על שלבים 4.6.9 ו 4.6.10 2 x עד 200 µL של הדגימות נאספים הצינורות microtiter.הערה: המטרה של ההליכים המתוארים בשלבים 4.6.10 ו 4.6.11 נועד להבטיח החלמה המרבי של התאים מהצלחת בנפח מצומצם. אם מספרי הטלפון הנייד לא דאגה, לאחר שלב 4.6.10, פשוט למעלה microtiter צינורות כדי µL 200 עם מאגר שטיפת FACS. להפעיל ניתוח cytometric זרימה של הדגימות ולנתח את התוצאות עם תוכנית ניתוח FACS, לפי שלב 3.5.11. הפעלת קספאז-3 וביטוי CD69 מנותחים בשער המכיל CD4+CD8+DP thymocytes.
Representative Results
הגישה וזמינותו ההקרנה מסוכם ב איור 1A. מעכבי קינאז הוקרנו קודם על השפעתם סמויה על יכולת הקיום thymocyte. כפקד חיובי עבור אפופטוזיס, דקסמתזון שימש סוכן proapoptotic. Gating עבור האוכלוסייה תא חי נקבע בהתבסס על הפקדים שלילי שלא טופלו שהפקדים שטופלו דקסמתזון חיובי (איור 1B). מעכבי נבדקו לראשונה ב- 10 מיקרומטר על thymocytes, אחוז התאים קיימא נמדדה לאחר המקננת על 18 h. חלון 20% עבור מוות תאים נבחר כך תרכובות וגרמתי גדול יותר מ- 20% אובדן תאי השער תא חי, לעומת הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד, נבדקו בריכוזים נמוכים (איור 1B). FACS נציג, חלקות דגימות שטופלו מעכב שנבחרו מוצגים להמחשת וזמינותו הכדאיות. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; רשויות אישורים 154447-36-6), מעכב PI3K22, לא להגביר באופן משמעותי מוות של תאים ב- 10 מיקרומטר, המדכא-10 מיקרומטר שומש את מבחני עוקבות. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; רשויות אישורים 1202884-94-3), מעכב כפול של PI3Kα/mTOR23, המושרה רמות גבוהות של מוות של תאים ב- 10 מיקרומטר ו- 1 מיקרומטר אך לא 0.1 מיקרומטר, 0.1 מיקרומטר היה נחוש בדעתו להיות הריכוז מתאים עבור יישום מבחני במורד הזרם. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3′,2′,1′-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; רשויות אישורים 62996-74-1), מעכב פאן-חלבון קינאז C עם יכולת הוקמה כדי לגרום אפופטוזיס24, המושרה בתא משמעותיים מוות בריכוזים כל נבדק, אפילו ב 0.1 מיקרומטר. זה היה בשימוש מבחני עוקבות-מיקרומטר 0.1 כפקד של חיוביים נוספים. ריכוז סופי מעכבי נבחרו על סמך הריכוזים הגבוהים ביותר שבו הם לא מרחיבים מוות של תאים על-ידי יותר מ- 20% מכלל הדגימות שטופלו דימתיל סולפוקסיד. עם ריכוז סופי מעכבי נחוש, צלחת מניות של מעכבי הוכן כך כל המעכבים היו 500 פעמים את הריכוז כאשר חל על התאים. איור 1C ממחיש את הפריסה צלחת צלחת מניות, עם ריכוז סופי מעכבי. בפרוטוקול חלופית של המקננת התאים ישירות הצלחות קטנות בנפח זרימה שכבתית שטיפה assay, השימוש באמצעי אחסון קטן המתחייבות לדילול נוסף לבית חולים. כדי להבטיח כי תוכן דימתיל סולפוקסיד התרבויות לאחר תוספת מעכב לא תהיה גבוהה מדי עבור התאים, מעכבי היו עוד יותר מעורבבת עם RPMI מלאה, במקדם דילול של 5, כך הם היו 100 פעמים המיועד הריכוז כאשר חל תאים. מעכבי, מדולל ריכוזי רעילים, שימשו וזמינותו של אפופטוזיס TCR-גירוי-induced thymocytes5,17. הגירוי בוצע באמצעות אנטי-CD3/CD28 חרוזים עבור 18 h, התאים היו מוכתמים לאחר מכן עבור הפעלת קספאז-3 ב- CD4+ ו CD8+ DP thymocyte האוכלוסייה (איור 2). עלייה קספאז-3 ההפעלה ואת הביטוי CD69, וגם TCR downregulation, נצפו גם את האנטי-CD3/CD28-גירוי וגם דימתיל סולפוקסיד-מוק-טיפול אנטי-CD3/28-גירוי הדגימות, לעומת הדגימות nonstimulated. הדגימות שטופלו דקסמתזון הראה עלייה קספאז-3 הפעלה עצמאית של קולטנים upregulation CD69, אשר צפוי של אפקט בתדר אפופטוזיס להיות עצמאית של גירוי TCR. איור 3A מסכם את התוצאות של הספרייה הקרנת assay עבור מעכבי שנבחרו. הפעלת קספאז-3 והן CD69 יכול לשמש כדי לזהות פוטנציאל מעכבי עניין בשל הדיכוי של הביטוי. כצפוי, מעכבי של מתווכים הקנוני של TCR איתות הופיע בתור חיובי כניסות במסכים. מעכבי כזה, אשר הציג בדרגות שונות של עוצמה מעכבות, כולל מעכבי רחבת-טווח שכוונו kinases מרובים ועוד, כמו כן, מעכבי ספציפיים. כמה מעכבי הצליחו לדכא את קספאז-3 הפעלה והן קולטנים upregulation CD69 (איור 3B, השורה העליונה, לוחות שמאלה). אחד מעכב כזה הוא bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; רשויות אישורים 137592-45-1), אשר מעכב כל חלבון קינאז C איזופורמים, בנוסף קינאז A ו PDK125,26,27. מעכב אחר בקטגוריה זו הוא CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CA 494772-86-0), מעכב המוצע של IKK228. היו תרכובות עכבות קולטנים upregulation CD69, אך לא לפגום הפעלה קספאז-3 (איור 3B, השורה העליונה, לוחות נכון). CAY10626, מעכב של PI3Kα, mTOR23, ו- U-0126 (2, 3-bis [אמינו [(2-aminophenyl) thio] מתילן]-butanedinitrile; רשויות אישורים 109511-58-2), מעכב MEK29, היו חלק מעכבי שזוהה. התוצאות מציגות כי מעכבי שונים מיקוד kinases שונה מענפים ספציפיים של מסלול איתות TCR, במיוחד אלה מיקוד kinases בשלב מאוחר, יכול לגרום ירידת ערך סלקטיבי התופעות הפעלה T-cell. היו שם גם מעכבי זה לא לדכא קולטנים upregulation CD69 וגם ההפעלה קספאז-3 (איור 3B, שורה תחתונה, לוחות שמאלה). פקליטקסל (βS-(benzoylamino) – αR – הידרוקסי-חומצה benzenepropanoic, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , אסתר 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl; רשויות אישורים 33069-62-4), מפצל של דינמיקה microtubule30ו- necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; רשויות אישורים 337349-54-9), מעכב של קינאז RIP131, הן שני מעכבי מזוהה להיות בקטגוריה זו. במקרים כאלה איפה קולטנים upregulation CD69 והפעלה קספאז-3 לא היו לקוי, זה יכול להיות עקב מעכבי לא מאתרת של קינאז הרלוונטיים של TCR איתות. כפי שהוזכר קודם, staurosporine שימש את המסכים, על ריכוז זה עדיין המושרה אפופטוזיס thymocytes. כצפוי, המדגם שטופלו staurosporine הראו רמות גבוהות של הפעלת קספאז-3 (איור 3B, שורה תחתונה, בעמודה הימנית). רמות נמוכות של CD69 הביטוי ניתן לייחס עיכוב בתיווך staurosporine של PKC, כפי bisindolylmaleimide II, מעכב עוד פאן-PKC, גם לדכא את הביטוי של CD69. לחלופין, staurosporine המושרה אפופטוזיס בתאים לפני שהם הצליחו upregulate הביטוי CD69. כדי להגביר את התפוקה ואת אוטומציה של הפרוטוקול, הוכנו פרוטוקולים מקבילים כרוך בשימוש צלחת אוטומטיות שטיפת המערכת באמצעות זרימה שכבתית. שני פרוטוקולים נפרד באמצעות התקן כביסה זה צלחת אוטומטיות היו trialed בהשוואה לשיטה המקובלת culturing בתאי לוחיות 96-ובכן, צביעת תאי פרוטוקול תלויי-צנטריפוגה. שיטה אחת מעורבת culturing התאים צלחות 96-ובכן, לפי הנוהל המקובל, והשלבים, העברת תאי תואם למכונת הכביסה צלחת אוטומטית הלוחות על ההכתמה (איור 4, דגימות DA-כביסה). השיטה האחרת מעורב culturing ישירות בתאים הלוחות תואמת-מכונת כביסה-צלחת וממשיכים עם פרוטוקול מכתימים באותה צלחת (איור 4, דגימות DA-תרבות). הפרוטוקולים צנטריפוגה תלויית לא נותנים הרבה ניגודים ונתנים פעיל קספאז-3, CD69, או TCRβ מכתים מדגמים שונים שנבדקו, לעומת בפרוטוקול צנטריפוגה תלוית קונבנציונאלי (איור 4). הבדלים בעוצמת מכתימים ניתן לייחס באמצעות נוגדנים בריכוזים שונים במקצת במהלך השלבים מוכתמים. איור 1 : Thymocyte הכדאיות לאחר טיפול עם מעכבי. (א) המתאר ניסיוני של הצעדים העיקריים ב וזמינותו ההקרנה. קיימות שלוש שיטות המוצע הגירוי, כתמים thymocytes בשימוש וזמינותו הפעלה, כלומר (1) culturing של thymocytes ב רגיל צלחות 96-ובכן, ואחריו מכתים באמצעות פרוטוקול מבוסס צנטריפוגה המקובלת, (2) culturing של thymocytes ב רגיל צלחות 96-ובכן, ואחריו מכתים באמצעות פרוטוקול תלוי צנטריפוגה-כביסה, ו- (3) culturing של thymocytes בתוך צלחות בנפח מצומצם, ואחריו מכתים לוחית לאותו שימוש פרוטוקול שאינו תלוי-צנטריפוגה כביסה. (B) Gating אסטרטגיות המשמשים את מבחני יכולת הקיום. השער תא חי נגזר מן הפיזור קדמי (FSC), לצד פיזור (האס) מתווה, כפי שתואר לעיל17. מעכבי שנמצאו גם רעיל-ריכוז שנבדקו היו עוד מבחני הכדאיות בריכוזים נמוכים 10-fold. מדגמים מייצגים שטופלו מעכב מוצגים. הערה הפקד הנפוץ (שטופלו דימתיל סולפוקסיד [דימתיל סולפוקסיד]) המשמש את 1 מיקרומטר ודוגמאות מיקרומטר 0.1. (ג) צלחת הפריסה של מעכבי מדולל. ייצוג סכמטי של לוחיות הרישוי. של מעכבי מעורבבת עם דימתיל סולפוקסיד כדי ריכוז של 500 x ריכוז סופי המיועד. כל אחד מייצג טוב אחד מעכב ייחודי; הבארות האפור הן ריקות. הריכוזים המוצגות הן הריכוז הסופי כאשר נוספו תרביות תאים, כלומר 10 מיקרומטר (אדום כהה), (פוקסיה) 1 מיקרומטר ו 0.1 מיקרומטר (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : צלחת הפריסה של וזמינותו הפעלת thymocyte. (למעלה) עמודות 1 ו-12 שמורים עבור פקדים, בעוד העמודות 2 עד 11 הן דגימות שטופלו מעכב (בז). בארות A1 כדי D1 שממלא הפקד שליליות (nonstimulated [NS]; אפור), ותופס הפקד חיובי עבור מוות של תאים (דקסאמתאזון שטופלו [דקס]; סגול) וולס E1 ל H1. עמודות 2 עד 12 מכילות thymocytes מגורה עם חרוזים אנטי-CD3/CD28. שממלא הפקד חיובי עבור הפעלת thymocyte (דוגמאות מגורה [α-CD3/CD28]; ירוק) וולס A12 D12 ולאחר הפקד הרכב (מגורה, שטופלו דימתיל סולפוקסיד [α-CD3/CD28 + דימתיל סולפוקסיד]; אדום) תופסת בארות E12 כדי H12. (למטה) Flow cytometry חלקות פעיל קספאז-3 (ActCasp3), CD69, ו TCRβ מכתים של thymocytes מגודרת בתוך השער (DP) כפול-חיוביות. מגרשים נציג של פקדים שונים מוצגים. NS = nonstimulated; דקס = דגימות שטופלו דקסמתזון; Α-CD3/CD28 + דימתיל סולפוקסיד = דגימות מגורה עם חרוזים CD3/CD28-מצופה ו שטופלו דימתיל סולפוקסיד; Α-CD3/CD28 = דגימות מגורה עם חרוזים CD3/CD28-מצופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : הקרנה של הספרייה מעכב על ההפעלה thymocyte. (א) סיכום נתונים של הפעלת וזמינותו. אלו הן התוצאות של ניסוי נציג מציג את הערכים המנורמל של תאים עם קספאז מופעל-3 ו- CD69 ביטוי עבור מעכבי שנבחרו. נורמליזציה נעשה על-ידי השוואת האחוז של תאים פעילים-קספאז-3-חיובית או שער CD69-חיובית לערך של הפקד שטופלו דימתיל סולפוקסיד, אשר מוגדר לערך היחסי של 0 בגרף. (B) נבחר FACS חלקות. חלקות cytometry זרימה של מעכבי זה דיכא קספאז-3 הפעלה והן קולטנים upregulation CD69 (למעלה משמאל), דיכא קולטנים רק CD69 upregulation (למעלה מימין), או לא היתה השפעה על הפעלת קספאז-3 ו- CD69 קולטנים upregulation (משמאל למטה). מגרשים של המדגם שטופלו staurosporine מוצגים כדי להמחיש את ההשפעות של שימוש מעכב בריכוזים רעילים (הימנית התחתונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : השוואה של הפרוטוקולים assay שונה. Flow cytometry חלקות פעיל קספאז-3 (ActCasp3), CD69, ואת וזמינותו TCRβ מכתים של DP thymocytes עוקב אחר שלושת הפרוטוקולים. ארבעה תנאים שונים נבדקים, כלומר הפקד שליליות (nonstimulated [NS]), את הפקד חיובי עבור מוות תאי (דקסאמתאזון שטופלו [דקס]), הפקד הרכב (מגורה, שטופלו דימתיל סולפוקסיד [α-CD3/CD28 + דימתיל סולפוקסיד]), מעכב- מטופלים לדוגמה (מגורה וטיפל פיק-75 [α-CD3/CD28 + פיק-75]). קונבנציונאלי = את culturing של thymocytes ב תקן 96-ובכן צלחות ואת מכתים עם פרוטוקול מבוסס צנטריפוגה קונבנציונאלי; DA-כביסה = culturing של thymocytes בתוך צלחות 96-ובכן תקן וצביעת באמצעות זרימה שכבתית שטיפה פרוטוקול; DA-תרבות = culturing של thymocytes בתוך צלחות בנפח מצומצם, צביעת לוחית אותו באמצעות זרימה שכבתית שטיפה פרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
האסטרטגיה ההקרנה המוצע כאן מעריך את היכולת של מעכבי מולקולה קטנה כדי לדכא את ההשפעות אפופטוטיים להיפגע ב thymocytes לאחר גירוי, בנוסף סמנים קונבנציונליים יותר של קולטנים upregulation הפעלה-CD69 T-cell TCR downregulation . סמנים נוספים ניתן גם לכלול כדי לאפשר הניתוח של קבוצות משנה שונים thymocyte32. האספקט המעניין וזמינותו הנוכחי טמון בעובדה כי מעכבי הפוגעים TCR איתות גם לצנן את אינדוקציה של אפופטוזיס, נוסף המדגיש את ההבחנה TCR שאינו תלוי תופעות שמעכבי יכול להיות על גרימת מוות של תאים. יתר על כן, וזמינותו זרימה-cytometry מבוססי מאפשר השימוש של מספר הקריאות הבאות כסמני הפעלה נפרדות, אשר יכולה לדווח את השפעות מעכבי על ענפים בודדים שונים של TCR איתות. במקרה המוצג כאן, היו מעכבי הראה על עיכוב דיפרנציאלית של הפעלת קספאז-3 וקולטנים upregulation CD69. כי תרכובות מסוימות עשוי להשפיע על פונקציות משק כגון סינתזה של חלבון או סחר vesicular, זה לא מפתיע להתבונן אפקטים על קולטנים של upregulation דה נובו מסונתז סמנים (למשל, CD69) אך לא על posttranslational שינויים (למשל, הפעלת הפרוטאוליטי של קספאז-3).
כמו וזמינותו שהוצגו כאן מודד אפופטוזיס כמו העתק, זה הכרחי כי ההשפעות הרעילות החבויים של מעכבי לא יסתירו את התוצאות. לדוגמה, במסך, אנחנו? האם לא לדלל staurosporine מעבר 1 ננומטר, למרות שזה עדיין רעילה לתאים-הריכוז הזה. התוצאות נציג הן מסכים עם staurosporine להיות מעכב קינאז מופקרת של משרן של אפופטוזיס33. בלי לדילול מספיקות של תרכובות נבדק ריכוזי רעילים, זה אפשרי להתעלם להיטים פוטנציאלים.
האסטרטגיה ההקרנה מפורט כאן יהיה קשה להחיל על בני אדם בשל סיבוכים הקשורים עם קבלת מספר מספיק של thymocytes להקרנה תפוקה גבוהה. עם זאת, ניתן לקבל התימוס האנושי דגימות הביופסיה של הלב ילדים34,35 או36,העוברים37. בכל זאת, כמו TCR איתות משעולים, רצפי חומצות אמינו איתות חלבונים בעיקר נשמרים בין בעכברים ובבני אדם, וזמינותו thymocyte מספק סינון ראשוני שימושי אסטרטגיה, והשיג תוצאות עם זה וזמינותו באמצעות העכבר thymocytes, לאחר מכן, ניתנת לאימות כמקורית העיקרי לימפוציטים אנושיים.
מגבלה אחת של פרוטוקול צנטריפוגה תלוית קונבנציונאלי מתייחס האפשרות של איבוד תאים, אשר ניתן לייחס אופי רב-שלבי התהליך, הכוללת צעדים כגון תא permeabilization, צנטריפוגה. כל צנטריפוגה וצעד resuspension באופן בלתי נמנע גורמת לאובדן של תאים. בעוד אובדן כזה לא יכול להיות קריטי עבור מחקרים שכללו מספר מצומצם של דוגמאות, זה עלול להעמיד את בעיות בעת החלת סינון תפוקה גבוהה יותר, במיוחד כמו assay עיצוב מתקדם 96-384 כדי 1536-ובכן. דרך אחת לעקוף בעיה זו היא באמצעות חיישנים תא חדיר קספאז פלורסנט38 המאפשרים הגילוי של קספאז ההפעלה תוך הימנעות את הסיבוכים של תא permeabilization, מנקי מספר5. לחלופין, העסקת שיטה שאינה תלויה צנטריפוגה לרחוץ את התאים על ידי זרימה שכבתית אפשרי גם להפחתה עד כדי איבוד תאים. עם צלחת אוטומטיות תחנת בשיתוף עם צלחת קיר-פחות רחיצת, תאים נשטפים על ידי זרימה שכבתית ללא שימוש צנטריפוגה. דילול מעריכית של ריאגנטים מאפשר יסודי ויעיל שטיפה של תאים בפחות מ 3 דקות, אשר מייצג של דילול שוות ערך ל שני סיבובים של כביסה צנטריפוגלי. ללא לחצים חיצוניים בשל צנטריפוגה, התאים הם מעשית יותר, תא הפסדים הן מזעריות.
חרשנו גם את האפשרות של שימוש לצלחת אוטומטיות תחנת רחיצת לאחר culturing את thymocytes ב 96-ובכן U-התחתון צלחות, בנוסף, את culturing של תאים ישירות בצלחות קיר-פחות תואם הצלחת אוטומטיות תחנת רחיצת. Culturing של תאים בהלוחות קיר-פחות זמינה חיסול של כל השלבים צנטריפוגה, ממוזער איבוד תאים על-ידי ביטול הצורך להעברת הדגימה על פני הלוחות. באופן כללי, שלושה פרוטוקולים שונים דומים גירוי היעילות והן מכתים. התחנה כביסה אוטומטיים מספקת את היתרון של אוטומציה, מהירות ויעילות, מה שהופך אותו קל יותר לניתוח תפוקה גבוהה יותר. יתר על כן, עם אוטומציה מוגברת, השלבים כביסה יכול להתבצע מהר יותר, יש יותר עקביות בין ניסויים או ניסויים. עם זאת, תחנת כביסה יש חסרונות מסוימים: כמויות גדולות של כביסה מאגרי נדרשים עבור מכונת כביסה הטרמה (150 מ”ל לכל שינוי מאגר, מהן 50 מ ל משמש לרחצה); טיפול נוסף נדרש בעת הטיפול לצלחת כדי למנוע כל זיהום צולב מן הבארות עקב החלוקה למחיצות מוגבלת בין הבארות של הצלחת בנפח מצומצם; מאגר שיורית של µL 25 ב הבארות לאחר כביסה מחייבת שימוש ריאגנטים מוכן במלון גבוהה יותר מאשר 1 x ריכוז. כדי לטפל הבעיות של נפח שיורית וקיבולת אחסון מוגבל של הצלחת, אביזר להרחיב הדגירה לאמצעי האחסון של 70 µL 150 µL ניתן להוסיף, הקלה על האימוץ של פרוטוקולים קונבנציונלי. בעוד מערכות אוטומטיות צלחת זמינים כיום, יש להם טביעת משמעותית לעומת המערכת למינריות לשטוף, אשר הוא יחידה קטנה של ~ 1 רגל מעוקב (~0.028 ז3). יתר על כן, השילוב של צנטריפוגה בצלחת אוטומטיות, מערכות טיפול הוא מאתגר, להגביל את השימוש בהם בכביסה לתא. כיום יש פלאפון צנטריפוגה-עצמאיים אחרים שטיפת הכלים העומדים לרשותנו, ככל הידוע לנו.
האסטרטגיה ההקרנה המובאת כאן היא היכולת לזהות מולקולות קטנות, ואת שלהם kinases המטרה כביכול, המשפיעות TCR איתות והפעלה T-cell. ספריית המשמש כאן כוללת בעיקר מעכבי מולקולה קטנה של kinases והיה מסוגל לייצר מספר שעשוי להיות מעניין להיטים. הפרוטוקול ניתן בקלות להחיל גם לספריות המדכא של מחלקות אחרות אנזים או סוגים אחרים של מולקולות קטנות, כמו גם ספריות של תרכובות אחרות (למשל, מקרומולקולות שונים). הפרוטוקול יכול לשמש גם למסך סוגי תאים אחרים, כגון היקפי לימפוציטים מסוג T או תאים מונצחים, כולל אלה ביטוי TCRs הטרנסגניים או נושא מערכות כתב. זיהוי ואפיון מתווכים חדשים של T-cell איתות ניתן לשפר את הידע שלנו על מסלול איתות, גם לסייע בפיתוח של טיפול ממוקד מחלות מערכת החיסון13,14,15, 16. בסך הכל, מחקר זה מוסיף מגוון האפשרויות הזמינות איתור מגשרים של T-cell איתות באמצעות תפוקה גבוהה מבחני המיון.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים סינגפור משרד הבריאות של המועצה הלאומית למחקר רפואי, NMRC CBRG15may017, את סינגפור משרד של החינוך, 2014-T2-1-136 (N.R.J.G.).
Materials
| RPMI | HyClone | SH30027FS | |
| FBS | HyClone | SH3007103 | |
| L-Glutamine | HyClone | SH3003401 | |
| Sodium pyruvate | HyClone | SH3023901 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 516732 | |
| 10X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
| Kinase Screening Library (96-Well) | Cayman Chemical | 10505 | Exact contents of the library may vary |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| anti-CD3/CD28 beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | |
| FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit | BD Pharmingen | 550480 | Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody |
| DA-Cell Washer | CURIOX | HT1000 | |
| 96-well DA-Cell Plate | CURIOX | 96-DC-CL-05 | |
| Antibodies | |||
| CD3e | BioLegend | 100236 | |
| TCRb | BD Biosciences | 553174 | |
| CD4 | BD Biosciences | 740007 | |
| CD8 | BD Biosciences | 563786 | |
| CD69 | eBioscience | 25-0699-42 | |
| Inhibitors | |||
| TG003 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PKC 412 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Doramapimod | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Paclitaxel | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erlotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-5 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-BEZ235 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Phthalazinone pyrazole | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-879 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 1-NA-PP1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Torin 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide II | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIBF 1120 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SMI-4a | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10657 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-703026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Chelerythrine chloride | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Tunicamycin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| GSK 1059615 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Ruxolitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Necrostatin-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 505124 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| INK128 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Canertinib (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 431542 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 173074 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Valproic Acid (sodium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 0325901 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| VX-702 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Emodin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BIO | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Imatinib (mesylate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sunitinib Malate | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Gefitinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 3-Methyladenine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide I | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide IV | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide V | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 663284 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D 4476 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NU 7026 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-9 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Indirubin-3'-monoxime | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-62 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-93 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CGP 57380 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Iso-Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Bisindolylmaleimide VIII (acetate) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ST638 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6656 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY364947 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 203580 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10621 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| YM-201636 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 447439 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-041164 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NVP-AEW541 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PP242 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ABT-869 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10622 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 17β-hydroxy Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10626 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SU 6668 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10572 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| N,N-Dimethylsphingosine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LY294002 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| U-0126 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Staurosporine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KN-92 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 (potassium salt) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| O-1918 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 98059 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 169316 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TGX-221 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (S)-H-1152 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-605240 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| D-erythro-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| OSU03012 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| JNJ-10198409 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Leelamine (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Arachidonic Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lauric Acid Leelamide | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-252424 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10505 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI-103 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PIK-75 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Sphingosine Kinase Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Piceatannol | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| (R)-Roscovitine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| BAY-43-9006 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10561 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AS-604850 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PI3-Kinase α Inhibitor 2 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ML-9 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Triciribine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Erbstatin Analog | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Kenpaullone | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Olomoucine | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-494 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-825 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1478 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 216763 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 415286 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-17 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-8 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| LFM-A13 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SC-514 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Apigenin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10554 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| DRB | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-13022 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| RG-14620 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-490 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-82 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-99 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-213 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-183 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Lavendustin C | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| ZM 336372 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| 5-Iodotubercidin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SB 202190 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10571 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Nilotinib | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| SP 600125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| L-threo-Sphingosine C-18 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| H-89 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| HA-1077 (hydrochloride) | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-370 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Wortmannin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| AG-1296 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| KT 5823 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Janex 1 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10574 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10575 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10576 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NH125 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| TWS119 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| NSC 210902 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10577 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CAY10578 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| PD 184161 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| CCT018159 | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
| Myricetin | Cayman Chemical | – | From the Kinase Screening Library |
References
- Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
- Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
- Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
- Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
- Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
- Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
- Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
- Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
- Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
- Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
- Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
- Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
- Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
- Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
- Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
- Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
- Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
- Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
- Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
- Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
- Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
- Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
- Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
- Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
- Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. . Novel compounds. , (2003).
- Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
- Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
- Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
- Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
- Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
- Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
- Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
- Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).
Cite This Article
Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).