Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Autoradiografie is een methode waarmee beelden van radioactief verval. De techniek is routinematig gebruikt om de studie van de verdeling van de weefsel van een proteïne van belang in vitro op basis van een specifieke farmacologische interactie tussen een radioactief gelabelde stof en haar doelstelling. Dit voorziet rechtstreekse informatie over de selectiviteit van het ligand in het doel. In vitro autoradiografie kan ook worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van farmacologische bindende parameters van radioligands, zoals de dissociatieconstante (K_d) en de dichtheid van bandplaatsen (B_max), alsmede voor het bepalen van de remming constante (K_i) van concurrerende liganden^1,2. Vergeleken met traditionele homogenaat radioligand binding, heeft autoradiografie het voordeel van kunnend visualiseren ruimtelijke anatomie en beknopte vermelding van regionale expressie patronen³. De methode van autoradiografie is daarom een relevante alternatief voor immunocytochemie, met name in het ontbreken van een gevalideerde antilichaam. Autoradiografie is eenvoudig toe te passen in een standaard isotoop laboratorium gegeven van de beschikbaarheid van een geschikte radioligand met de vereiste farmacologische specificiteit, toegang tot een microtoom cryostaat voor het voorbereiden van weefselsecties, en een geschikte beeldvorming apparaat welk vermag de verdeling van de radioactiviteit in de respectieve weefselsecties analyseren. Met name is een belangrijk selectiecriterium voor de radioligand een beperkte hoeveelheid binding aan doelsoort sites. Dit kan naar andere eiwitten, membranen of materialen zoals plastic of filters, en wordt gezamenlijk aangeduid als niet-specifieke binding. Meestal kan niet-specifieke binding is niet-verzadigbare maar verzadigbare als het gaat om een specifieke uit-target proteïne. De beste manier van valideren waar specifieke binding is te vergelijken met weefsels ontbreekt het doel, bijvoorbeeldgenetisch gemanipuleerde (knock-out) weefsel⁴.

De methodologie is hier, geïllustreerd met de autoradiografie karakterisering van de hoge-affiniteit bindende site voor zuur van γ-hydroxybutyraat (GHB) in de hersenen van zoogdieren. Inzicht in de farmacologische interactie tussen GHB en zijn bindende plaats is van belang als GHB zowel een klinisch nuttig drug in de behandeling van narcolepsie en alcoholisme⁵, maar ook een natuurlijk bestanddeel van de zoogdieren hersenen en een recreatieve is drug⁶. Hoge-affiniteit GHB bandplaatsen waren eerst beschreven met behulp van [³H] GHB binding aan de rat hersenen homogenaat⁷. Door de jaren heen, verder autoradiografie studies met [³H] GHB en de analoge [³H] NCS-382 heeft een hoge dichtheid van bindende sites in reukkolf gebieden van rat^8,9,10, muis⁹ , varken¹¹en aap/mens hersenen¹². De moleculaire identiteit en exacte functionele relevantie van deze bandplaatsen hebben bleef echter ongrijpbaar.

Met de bedoeling om te verder karakteriseren de bandplaatsen en te vergemakkelijken van studies over de fysiologische rol van GHB, meerdere radioligands integratie van verschillende isotopen begiftigd met verschillende affiniteiten zijn ontwikkeld ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA en [¹²⁵ik] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(herzien in¹⁷) (figuur 1). De combinatie van selectieve hoge-affiniteit radioligands inwoners en een bevolkingsdichtheid van de zeer hoge weefsel van de binding sites hebben toegestaan voor de productie van hoge-kwaliteit beelden met behulp van de fosfor imaging techniek^9,11. Samen met een overzicht van de praktische punten bij het opzetten van een autoradiografie experiment en een illustratie te illustreren details, zal de sectie discussie benadrukken i) de keuze van de radionuclide, ii) de keuze van assay voorwaarden, en iii) het gebruik van fosfor Imaging platen versus X-ray film. Het algemene doel van deze paper is te voorzien in technische, methodologische en wetenschappelijke bijzonderheden over de techniek van autoradiografie informeren over weefsel distributie en farmacologische analyse van eiwit doelen.