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Neuroscience

Autoradiographie comme une méthode Simple et puissante pour la visualisation et la caractérisation des cibles pharmacologiques

Published: March 12, 2019
doi:
10.3791/58879
, , ,
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI,Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET,Copenhagen University Hospital

Summary

La méthode d’autoradiographie est systématiquement utilisée pour étudier la liaison des radioligands sections de tissu pour la détermination de la pharmacologie qualitative ou quantitative.

Abstract

In vitro autoradiographie a pour but de visualiser la répartition anatomique d’une protéine d’intérêt dans les tissus des animaux de laboratoire ainsi que les êtres humains. La méthode est basée sur la liaison spécifique d’un radioligand vers sa cible biologique. C’est pourquoi, coupes de tissus congelés sont incubés avec solution radioligand, et la liaison à la cible est ensuite localisée par la détection de la radioactivité, par exemple, en utilisant le film photosensible ou plaques-images au phosphore. Autoradiogrammes numériques qui en résulte affichent une résolution spatiale remarquable, ce qui permet la quantification et la localisation des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. En outre, quantification permet la caractérisation pharmacologique de l’affinité du ligand au moyen des constantes de dissociation (Kd), les constantes d’inhibition (Kj’ai) ainsi que la densité des sites de fixation (Bmax) dans les tissus choisis. Ainsi, la méthode fournit des informations sur la localisation de la cible tant de sélectivité de ligand. Ici, la technique est illustrée avec caractérisation autoradiographique de l’acide de haute affinité gamma-hydroxybutyrique (GHB) accepteurs dans le tissu de cerveau des mammifères, avec un accent particulier sur les considérations d’ordre méthodologiques concernant l’essai de liaison paramètres, le choix de la méthode de détection et de radioligand.

Introduction

Autoradiographie est une méthode qui fournit des images de désintégration radioactive. La technique est couramment utilisée pour étudier la distribution tissulaire d’une protéine d’intérêt en vitro basée sur une interaction pharmacologique spécifique entre un composé radiomarqué et sa cible. Ceci fournit des informations directes sur la sélectivité du ligand pour la cible. In vitro autoradiographie peut également être utilisé pour la détermination quantitative des paramètres de liaison pharmacologique des radioligands, tels que la constante de dissociation (Kd) et la densité des sites de fixation (Bmax), ainsi que pour déterminer la constante d’inhibition (Ki) concurrentes des ligands1,2. Par rapport aux traditionnels homogénat radioligands, autoradiographie a l’avantage d’être en mesure de visualiser l’anatomie du spatial et donnant des détails succincts sur expression régionale modèles3. La méthode d’autoradiographie est donc une alternative pertinente à l’immunocytochimie, surtout en l’absence d’un anticorps validé. Autoradiographie est facilement mis en œuvre dans un laboratoire de radio-isotope standard compte tenu de la disponibilité d’un radioligand adapté avec la spécificité pharmacologique requise, l’accès à un cryostat microtome servant à préparer des sections de tissu et une imagerie adaptée appareil qui est capable d’analyser la répartition de la radioactivité dans les sections respectives de tissu. Notamment, un critère de sélection important pour radioligand est une quantité limitée de liaison aux sites non ciblés. Ceci peut être à d’autres protéines, les membranes ou les matériaux comme le plastique ou les filtres et est collectivement dénommé non-spécifiques. Habituellement, non-spécifiques est non saturable mais peut être saturable si il s’agit d’une protéine spécifique de la cible. Le meilleur moyen de validation véritable fixation spécifique est à comparer aux tissus manque la cible, par exemple, génétiquement machiné des tissus (knock-out)4.

Ici, la méthode est illustrée par la caractérisation autoradiographique du site de liaison de haute affinité pour l’acide gamma-hydroxybutyrique (GHB) dans le cerveau des mammifères. Comprendre l’interaction pharmacologique du GHB et son site de liaison est pertinent que le GHB est une drogue tant cliniquement utile dans le traitement de la narcolepsie et l’alcoolisme5, mais aussi un constituant naturel du cerveau mammifère et un loisir 6de drogue. Sites de liaison de haute affinité GHB ont été les premiers décrits à l’aide de la [3H] liant de GHB au cerveau de rat homogénat7. Au cours des années, poursuivre des études d’autoradiographie [3H] GHB et l’analogue de la [3H] NCS-382 a montré une forte densité de sites dans les régions du cerveau de rat8,9,10, souris9 de liaison ,11et singe/homme cerveau12de porc. Cependant, l’identité moléculaire et la pertinence fonctionnelle exact de ces sites de liaison sont restés insaisissables.

Avec l’intention de mieux caractériser les sites de liaison et à faciliter les études sur le rôle physiologique du GHB, multiples radioligands incorporant différents isotopes dotés d’affinités différentes ont été développés ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA et [125j’ai] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revu en17) (Figure 1). La combinaison des radioligands de haute affinité sélective et une densité de tissu très élevée de la liaison de sites ont permis pour la production d’images de haute qualité en utilisant la technique9,11-images au phosphore. Ainsi qu’un aperçu des points pratiques à mettre en place une expérience autoradiographique et une illustration pour illustrer les détails, la section discussion mettra l’accent sur i) le choix du radionucléide, ii) le choix des conditions expérimentales et iii) l’utilisation de phosphore plaques d’imagerie contre le film radiographique. L’objectif général de ce document est de fournir des détails techniques, méthodologiques et scientifiques sur la technique d’autoradiographie pour informer la distribution tissulaire et analyse pharmacologique des protéines cibles.

Protocol

Tous les animaux de manutention a été réalisée en conformité avec les directives de l’inspection d’expérimentation animale danois. Remarque : Le protocole décrit ici couvre la préparation du tissu (c.-à-d., tissu de cerveau de souris), l’essai in vitro autoradiographique avec suffisamment de détails pour mettre en place la méthode dans un nouveau laboratoire, l’exposition aux images de plaques au phosphore ainsi que analyse densitométrique subséquente d?…

Representative Results

En utilisant le protocole décrit, la répartition anatomique des sites de liaison de haute affinité GHB a été visualisée avec l’analogue GHB radiomarqué [3H] HOCPCA dans le cerveau de souris, qui a été coupé en sections coronales, sagittales et horizontales (Figure 3 ). Des niveaux élevés de liaison ont été observés dans l’hippocampe et le cortex, une liaison plus faible dans le striatum et aucune liaison n’a été détectés da…

Discussion

La qualité d’un test autoradiographique est le plus souvent déterminée par la sensibilité au radioligand. Un facteur important est le radio-isotope sélectionné, qui est indiqué par la disponibilité de ligands connus ou de la faisabilité des techniques spécifiques de l’étiquetage à céder des ligands avec une activité spécifique appropriée (c’est-à-dire, la quantité de radioactivité par mole d’unité un radioligand)23et avec une quantité limitée de dégradation ch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le travaux ont été subventionnés par la fondation de Lundbeck (Grant R133-A12270) et le Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Les auteurs remercient Dr Aleš Marek pour la fourniture du radioligand [3H].

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597
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Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).
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