JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Авторадиографии как простой и мощный метод для визуализации и характеристика фармакологического целей

Published: March 12, 2019
doi:
10.3791/58879
, , ,
1Department of Drug Design and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 2Neurobiology Research Unit and CIMBI,Copenhagen University Hospital, 3Department of Clinical Physiology, Nuclear Medicine & PET,Copenhagen University Hospital

Summary

Методом авторадиографии обычно используется для изучения привязки radioligands в разделах ткани для определения качественных или количественных фармакологии.

Abstract

В vitro авторадиографии стремится визуализации анатомического распределения протеин интереса в ткани экспериментальных животных, а также людей. Метод основан на конкретной привязки лиганд своей биологической цели. Таким образом замороженные ткани секции инкубируют с решением лиганд, и привязки к целевому впоследствии локализуется путем обнаружения радиоактивного распада, например, с помощью светочувствительной пленки или фосфора изображений пластины. Результате цифровой autoradiograms отображения замечательные пространственного разрешения, который позволяет количественной и локализации лиганд привязки в различных анатомических структур. Кроме того количественная оценка позволяет фармакологическая характеристика сродство лиганда с помощью константы диссоциации (dK), константы ингибирования (Kя), а также плотность сайтов связывания (BМакс) в отдельных тканях. Таким образом метод предоставляет сведения о локализации целевого и лигандом избирательности. Здесь техника проявляется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные гамма-оксимасляная кислота (ГОМК) привязки сайтов в ткани мозга млекопитающих, с особым упором на методологические соображения относительно привязки пробирного параметры, выбор лиганд и метод обнаружения.

Introduction

Авторадиографии — это метод, который предоставляет изображения радиоактивного распада. Метод обычно используется для изучения распределения ткани протеина интереса в vitro на основе конкретных фармакологических взаимодействия между радиоизотопами соединения и его цель. Это обеспечивает прямую информацию о избирательность лигандом для целевого объекта. Радиоавтографией в пробирке может также использоваться для количественного определения фармакологических привязки параметров radioligands, таких как Константа диссоциации (dK) и плотности сайтов связывания (BМакс), а также для определения Ингибирование константа (iK) конкурирующих лигандов1,2. По сравнению с традиционными огневки лиганд привязки, радиоавтография имеет преимущество возможность визуализировать пространственных анатомии и кратким указанием региональных выражение модели3. Методом авторадиографии является поэтому соответствующие альтернативы immunocytochemistry, особенно в отсутствие проверенных антитела. Авторадиографии легко реализуется в стандартной радиоизотопной лаборатории, при условии наличия подходящего лиганд с необходимые фармакологических специфичность, доступ к микротом криостат для подготовки разделов ткани и подходящих изображений устройство, которое имеет возможность анализа распределения радиоактивности в разделах соответствующие ткани. В частности важным критерием отбора для лиганд является ограниченное количество привязки на сайты, не являющиеся объектом. Это может быть другие белки, мембраны или такие материалы, как пластик или фильтры и коллективно называется неспецифичный привязки. Обычно неспецифичный привязки не конденсаторе, но может быть конденсаторе, если она включает в себя конкретные-целевого белка. Лучший способ проверки истинный конкретной привязки является для сравнения тканей, генетически не хватает целевого объекта, например, инженерии тканей (нокаут)4.

Здесь методология иллюстрируется с autoradiographic характеристика высокоспецифичные связывающие сайта для γ-оксимасляная кислота (ГОМК) в мозге млекопитающих. Понимание фармакологических взаимодействия между ГОМК и его привязки сайта имеет значение как ГОМК снадобье как клинически полезным в лечении нарколепсии и алкоголизма5, но также природных составляющих млекопитающих мозга и отдыха наркотиками6. Высокоспецифичные ГОМК привязки сайтов впервые были описаны с помощью [3H] ГОМК привязки для мозга крысы огневки7. С годами, дальнейших исследований авторадиографии с [3H] ГОМК и аналог [3H] NCS-382 показал высокую плотность привязки сайтов в регионах мозга крысы8,9,10, мыши9 , свинья11и обезьяна/человеческий мозг12. Однако молекулярной идентификации и точное функциональные актуальность этих сайтов связывания остаются недостижимой.

С намерением для дальнейшей характеризации привязки сайтов и для облегчения исследования о физиологической роли ГОМК, были разработаны несколько radioligands включения различных изотопов, наделенных различными сходство ([3H] ГОМК, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA и [125я] BnOPh-GHB)13,14,,1516(обзор в17) (рис . 1). Сочетание выборочного высокоспецифичные radioligands и ткани очень высокой плотности привязки сайтов, позволили для производства высококачественных изображений с использованием люминофора, изображений техники9,11. Наряду с изложение практических точек в создании эксперимент autoradiographic и иллюстрации иллюстрируют детали в разделе обсуждения особое внимание будет уделяться i) выбор радионуклидов, ii) выбор условий пробирного и iii) использование фосфора визуализации пластины по сравнению с рентгеновской пленки. Общая цель этого документа заключается в том, предоставлять технических, методологических и научных сведений по технике авторадиографии для информирования о распределении ткани и фармакологические анализа белковых мишеней.

Protocol

Все животные обработка была выполнена в соответствии с руководящими принципами датского инспекции экспериментов животных. Примечание: Протокол, описанные здесь охватывает Подготовка тканей (т.е., ткани мозга мыши), в пробирке autoradiographic assay достаточно подробно д?…

Representative Results

С помощью описанных протокола, анатомические распределение сайтов связывания ГОМК высокоспецифичные был визуализирован с радиоизотопами ГОМК аналог [3H] HOCPCA в мозг мыши, который был сокращен на корональных, сагиттальной и горизонтальные секции (рис. 3…

Discussion

Качество autoradiographic assay чаще всего определяется чувствительность лиганд. Важным фактором является выбранный радиоизотопных, которая дается путем наличия известных лигандами или осуществимость конкретных методов маркировки приносить лигандов с соответствующей удельной активностью (<e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа была поддержана Фондом компании «Лундбек» (Грант R133-A12270) и Ново Нордиск Foundation (Grant NNF0C0028664). Авторы благодарят доктор Aleš Marek на поставку лиганд [3H].

Materials

Absolute ethanol Merck Millipore 107017
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate GE Healthcare Life Science 28956481 20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate Sigma-Aldrich C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy) Merck Millipore 100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL Sakura 4583 Tissue-Tek
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005-1KG-R
Superfrost Plus slides VWR 631-9483 microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set Sakura Finetek Denmark ApS 4451
Tritium Standard on Glas American Radiolabeld Chemicals, Inc. ART 0123
Xylene substitute Sigma-Aldrich A5597
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upham, L. V., Englert, D. F. . Handbook of Radioactivity Analysis. , 1063-1127 (2003).
  2. Manuel, I., et al. Neurotransmitter receptor localization: From autoradiography to imaging mass spectrometry. ACS Chemical Neuroscience. 6, 362-373 (2015).
  3. Pavey, G. M., Copolov, D. L., Dean, B. High-resolution phosphor imaging: validation for use with human brain tissue sections to determine the affinity and density of radioligand binding. Journal of Neuroscience Methods. 116, 157-163 (2002).
  4. Davenport, A. P. . Receptor Binding Techniques. 897, (2012).
  5. Busardò, F. P., Kyriakou, C., Napoletano, S., Marinelli, E., Zaami, S. Clinical applications of sodium oxybate (GHB): from narcolepsy to alcohol withdrawal syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19, 4654-4663 (2015).
  6. Wong, C. G. T., Gibson, K. M., Snead, O. C. I. From the street to the brain: neurobiology of the recreational drug γ-hydroxybutyric acid. Trends in Pharmacological Sciences. 25, 29-34 (2004).
  7. Benavides, J., et al. High affinity binding site for γ-hydroxybutyric acid in rat brain. Life Sciences. 30, 953-961 (1982).
  8. Hechler, V., Gobaille, S., Maitre, M. Selective distribution pattern of y-hydroxybutyrate receptors in the rat forebrain and midbrain as revealed by quantitative autoradiography. Brain Research. 572, 345-348 (1992).
  9. Klein, A. B., et al. Autoradiographic imaging and quantification of the high-affinity GHB binding sites in rodent brain using 3H-HOCPCA. Neurochemistry International. 100, 138-145 (2016).
  10. Gould, G. G., Mehta, A. K., Frazer, A., Ticku, M. K. Quantitative autoradiographic analysis of the new radioligand [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[α][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid ([3H]NCS-382) at γ-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in rat brain. Brain Research. 979, 51-56 (2003).
  11. Jensen, C. H., et al. Radiosynthesis and evaluation of [11C]3-hydroxycyclopent-1- enecarboxylic acid as potential PET ligand for the high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. ACS Chemical Neuroscience. , 22-27 (2017).
  12. Castelli, M. P., Mocci, I., Langlois, X., Gommeren, W., Luyten, W. H. M. L. Quantitative autoradiographic distribution of γ-hydroxybutyric acid binding sites in human and monkey brain. Molecular Brain Research. 78, 91-99 (2000).
  13. Wellendorph, P., et al. Novel radioiodinated γ-hydroxybutyric acid analogues for radiolabeling and photolinking of high-affinity γ-hydroxybutyric acid binding sites. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335, 458-464 (2010).
  14. Vogensen, S. B., et al. New synthesis and tritium labeling of a selective ligand for studying high-affinity γ-hydroxybutyrate (GHB) binding sites. Journal of Medicinal Chemistry. 56, 8201-8205 (2013).
  15. Mehta, A. K., Muschaweck, N. M., Maeda, D. Y., Coop, A., Ticku, M. K. Binding characteristics of the γ-hydroxybutyric acid receptor antagonist [3H](2E)-(5-hydroxy-5,7,8,9-tetrahydro-6H-benzo[a][7]annulen-6-ylidene) ethanoic acid in the rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 299, 1148-1153 (2001).
  16. Kaupmann, K., et al. Specific γ-hydroxybutyrate-binding sites but loss of pharmacological effects of γ-hydroxybutyrate in GABAB(1)-deficient mice. Neuroscience. 18, 2722-2730 (2003).
  17. Bay, T., Eghorn, L. F., Klein, A. B., Wellendorph, P. GHB receptor targets in the CNS: Focus on high-affinity binding sites. Biochemical Pharmacology. 87, 220-228 (2014).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2008).
  19. Carletti, R., Tacconi, S., Mugnaini, M., Gerrard, P. Receptor distribution studies. Current Opinion in Pharmacology. 35, 94-100 (2017).
  20. Wellendorph, P., et al. Novel cyclic γ-hydroxybutyrate (GHB) analogs with high affinity and stereoselectivity of binding to GHB sites in rat brain. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 315, 346-351 (2005).
  21. Coenen, H. H., et al. Consensus nomenclature rules for radiopharmaceutical chemistry – Setting the record straight. Nuclear Medicine and Biologly. 55, (2017).
  22. DeBlasi, A., O’Reilly, K., Motulsky, H. J. Calculating receptor number from binding experiments using same compound as radioligand and competitor. Trends in Pharmacological Science. 10, 227-229 (1989).
  23. Hulme, E. C. . Receptor-ligand interactions: a practical approach. , (1992).
  24. Holm, P., et al. Plaque deposition dependent decrease in 5-HT2A serotonin receptor in AβPPswe/ PS1dE9 amyloid overexpressing mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 20, 1201-1213 (2010).
  25. Thomsen, C., Helboe, L. Regional pattern of binding and c-Fos induction by (R)- and (S)-citalopram in rat brain. Neurochemistry. 14, 2411-2414 (2003).
  26. López-Giménez, J. F., Mengod, G., Alacios, J. M., Vilaró, M. T. Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 ,907. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. , 446-454 (1997).
  27. Alexander, G. M., Schwartzman, R. J., Bell, R. D., Yu, J., Renthal, A. Quantitative measurement of local cerebral metabolic rate for glucose utilizing tritiated 2-deoxyglucose. Brain Research. 223, 59-67 (1981).
  28. Kuhar, M. J., Unnerstall, J. R. Quantitative receptor mapping by autoradiography: some current technical problems. Trends in Neurosciences. , 49-53 (1985).
  29. Kuhar, M. J., De Souza, E. B., Unnerstall, J. R. Neurotransmitter receptor mapping by autoradiography and other methods. Annual Review of Neuroscience. , 27-59 (1986).
  30. Chen, H. -. T., Clark, M., Goldman, D. Quantitative Autoradiography of 3H-Paroxetine Binding Sites in Rat Brain. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 27, 209-216 (1992).
  31. Herkenham, M., Pert, C. B. Light microscopic localization of brain opiate receptors: a general autoradiographic method which preserves tissue quality. Journal of Neuroscience. 2, 1129-1149 (1982).
  32. Heimer, L., Záborszky, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods 2 – Recent progress. , (1989).
  33. Vessotskie, J. M., Kung, M. P., Chumpradit, S., Kung, H. F. Quantitative autoradiographic studies of dopamine D3receptors in rat cerebellum using [125I]S(-)5-OH-PIPAT. Brain Research. 778, 89-98 (1997).
  34. Klein, A. B., et al. 5-HT2A and mGLU2receptor binding levels are related to differences in impulsive behavior in the roman low- (RLA) and high- (RHA) avoidance rat strains. Neuroscience. , 36-45 (2014).
  35. Johnston, R. F., Pickett, S. C., Barker, D. L. Autoradiography using storage phosphor technology. Electrophoresis. 11, 355-360 (1990).
  36. Ito, T., Suzuki, T., Lim, D. K., Wellman, S. E., Ho, I. K. A novel quantitative receptor autoradiography and in situ hybridization histochemistry technique using storage phosphor screen imaging. Journal of Neuroscience Methods. 59, 265-271 (1995).
  37. Amemiya, Y., Miyahara, J. Imaging plate illuminates many fields. Nature. 336, 89-90 (1988).
  38. Kanekal, S., Sahai, A., Jones, R. E., Brown, D. Storage-phosphor autoradiography: a rapid and highly sensitive method for spatial imaging and quantitation of radioisotopes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. , 171-178 (1995).
  39. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry – issues concerning methods , utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2011).
  40. Uhl, P., Fricker, G., Haberkorn, U., Mier, W. Radionuclides in drug development. Drug Discovery Today. 20, 198-208 (2015).
  41. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: Implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biolology. 32, 719-725 (2005).
  42. Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 9232-9258 (2014).
  43. Kristensen, J. L., Herth, M. M. In vivo imaging in drug discovery. Drug Design and Discovery. , 119-135 (2017).
  44. Cunha, L., Szigeti, K., Mathé, D., Metello, L. F. The role of molecular imaging in modern drug development. Drug Discovery Today. 19, 936-948 (2014).
  45. Bailly, C., et al. Comparison of Immuno-PET of CD138 and PET imaging with 64CuCl2and18F-FDG in a preclinical syngeneic model of multiple myeloma. Oncotarget. 9, 9061-9072 (2018).
  46. Sóvágó, J., Makkai, B., Gulyás, B., Hall, H. Autoradiographic mapping of dopamine-D2/D3receptor stimulated [35S]GTPγS binding in the human brain. European Journal of Neuroscience. 22, 65-71 (2005).
  47. Sóvágó, J., Dupuis, D. S., Gulyás, B., Hall, H. An overview on functional receptor autoradiography using [35S]GTPγS. Brain Research Reviews. 38, 149-164 (2001).
  48. Solon, E. G. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 25, 543-555 (2012).
  49. Donnelly, D. J. Small molecule PET tracers in drug discovery. Seminars in Nuclear Medicine. 47, 454-460 (2017).

Tags

AutoradiographyProtein BindingPharmacological TargetsCryostat SectioningRadioligand LabelingNon-specific BindingSpatial ResolutionDigital ImagingPharmacological Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Griem-Krey, N., Klein, A. B., Herth, M., Wellendorph, P. Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets. J. Vis. Exp. (145), e58879, doi:10.3791/58879 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image