Autoradiographie als eine einfache und leistungsfähige Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von pharmakologischen Ziele

Autoradiographie ist eine Methode, die Bilder des radioaktiven Zerfalls liefert. Die Technik wird routinemäßig eingesetzt, um die Gewebeverteilung eines Proteins des Interesses in Vitro basierend auf eine spezifische pharmakologische Interaktion zwischen einer radioaktiv Verbindung und ihr Ziel zu studieren. Dies bietet direkte Informationen über die Selektivität des Liganden für das Ziel. In-vitro- Autoradiographie kann auch verwendet werden, für die quantitative Bestimmung der pharmakologischen Bindungsparameter von Radioligands, wie z. B. die Dissoziationskonstante (K-_d) und die Dichte der Bindungsstellen (B_max), sowie für die Bestimmung die Hemmung-Konstante (K_i) von konkurrierenden Liganden^1,2. Im Vergleich zu traditionellen Homogenat Radioligand Bindung, hat Autoradiographie den Vorteil des Seins in der Lage, räumliche Anatomie zu visualisieren und prägnante Angabe der regionalen Ausdruck Muster³. Die Methode der Autoradiographie ist daher eine entsprechende Alternative zu Immunocytochemistry, insbesondere in der Abwesenheit eines validierten Antikörpers. Autoradiographie ist in einem standard Radioisotop Labor angesichts der Verfügbarkeit von geeigneten Radioligand mit der erforderlichen pharmakologischen Spezifität, Zugriff auf ein Mikrotom Kryostat für die Zubereitung von Gewebeschnitten und eine geeignete Imaging einfach umsetzen. Gerät, das die Verteilung der Radioaktivität in den jeweiligen Gewebeschnitten analysieren kann. Bemerkenswert ist, ist ein wichtiges Auswahlkriterium für die Radioligand eine begrenzte Menge an Bindung an Nichtziel-Seiten. Dies kann an andere Proteine, Membranen oder Materialien wie Kunststoff oder Filter, und ist gemeinsam als unspezifische Bindung bezeichnet. In der Regel kann unspezifische Bindung ist nicht Humanserumproteine aber Humanserumproteine wenn es handelt sich um ein bestimmtes Ziel-Protein. Der beste Weg der Validierung wahre spezifische Bindung ist vergleichbar zu den Geweben fehlt das Ziel, z.B.genetisch (Knock-out) Gewebe⁴entwickelt.

Hier ist die Methode mit der autoradiographischen Charakterisierung der hohen Affinität Bindungsstelle für γ-Hydroxybutyric Säure (GHB) in das Gehirn von Säugetieren illustriert. Verständnis der pharmakologischen Wechselwirkung zwischen GHB und seine Bindungsstelle ist von Bedeutung, da GHB sowohl ein klinisch nützlich Medikament in der Behandlung von Narkolepsie und Alkoholismus⁵, sondern auch ein natürlicher Bestandteil der das Gehirn von Säugetieren und ein Erholungs-ist Droge-⁶. Hohe Affinität GHB Bindungsstellen wurden erstmals über [³H] GHB Bindung an Ratte Gehirn Homogenat⁷beschrieben. Im Laufe der Jahre weitere Autoradiographie Studien mit [³H] GHB und die analoge [³H] NCS-382 zeigte eine hohe Dichte an Bindungsstellen im Vorderhirn Regionen Ratte^8,9,10, Maus⁹ ,¹¹und Affe/Mensch Gehirn¹²Schwein. Jedoch blieben die molekulare Identität und genaue funktionelle Relevanz der diese Bindungsstellen schwer fassbaren.

Mit der Absicht, weiter die Bindungsstellen charakterisieren, und Studien über die physiologische Rolle von GHB zu erleichtern, wurden mehrere Radioligands mit verschiedenen Isotopen, ausgestattet mit verschiedenen Affinitäten entwickelt ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA und [¹²⁵ich] BnOPh GHB)^13,14,15,16(rezensiert in¹⁷) (Abbildung 1). Die Kombination von selektiven High-Affinity Radioligands und eine sehr hohe Gewebe Dichte der Bindung, die Standorte für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Bilder mit den Phosphor imaging Technik^9,11erlaubt haben. Zusammen mit einen Überblick über die praktischen Punkte bei der Einrichtung ein autoradiographischen Experiment und eine Illustration zu Details zu veranschaulichen wird die Diskussion Abschnitt (i) die Wahl des Radionuklids, (Ii) die Wahl der Assay-Bedingungen und (Iii) die Verwendung von Phosphor betonen. Bildplatten versus Röntgenfilm. Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, die wissenschaftlichen, technischen und methodischen Details auf die Autoradiographie Technik zur Verfügung, für die Information über Gewebeverteilung und pharmakologische Analyse von Protein-Targets.