Multiplexage axé Stimulation ultrason avec la microscopie en Fluorescence

De nombreuses maladies nécessitent une forme quelconque d’intervention médicale invasive. Ces procédures sont souvent coûteux, risqué, exigent des périodes de récupération et donc ajouter un fardeau aux systèmes de soins de santé. Modalités thérapeutiques non invasifs sont susceptibles de fournir des solutions de rechange sûres et peu coûteuse pour des procédures chirurgicales conventionnelles. Toutefois, les approches actuelles non invasives telles que la stimulation magnétique transcrânienne ou de pharmacothérapie sont souvent limités par des compromis entre la pénétration tissulaire, résolution spatio-temporelle et des effets indésirables hors cible. Dans ce contexte, un ultrasons focalisés constituent une technologie non invasive prometteuse avec la possibilité de manipuler les fonctions biologiques profondément à l’intérieur des tissus avec haute précision spatio-temporelle et limité les effets hors cible.

Ultrasons focalisés stimulation consiste en délivrant une énergie acoustique à des emplacements précis profondément à l’intérieur des organismes vivants. En fonction des paramètres d’impulsions acoustiques, cette énergie peut avoir une variété d’utilisations médicales. Par exemple, la Food and Drug Administration a approuvé l’utilisation d’ultrasons de concentré de haute intensité (HiFU) pour ablation thermique de tumeurs prostatiques, causant des tremblements des régions du cerveau, les fibromes utérins et causant douleur de terminaisons nerveuses dans les métastases osseuses¹ . Cavitation induite par HiFu microbulles est également utilisée pour ouvrir transitoirement la barrière hémato – encéphalique pour l’administration ciblée de produits thérapeutiques administrés par voie générale². L’intensité moyenne des impulsions spatiale de pointe (j’ai_LECL) et spatial-pic d’intensité moyenne temporelle (j’ai_spta) utilisé pour HiFU applications sont généralement au-dessus de plusieurs kW cm^-2 et produisent la pression différentielle de plusieurs dizaines de MPa. Ces valeurs sont bien au-dessus de la FDA a approuvé I_LECL et j’ai_spta limites d’échographie diagnostique, de 190 W cm^-2 et de 720 mW cm^-2, respectivement³. En revanche, les études récentes ont montré que la stimulation non destructifs ultrasons pulsés qui sont dans ou près de la plage des limites d’intensité de diagnostic par ultrasons (LIPUS) peut être efficace pour manipuler les neurones à distance et en toute sécurité de tir^{4, 5,6,7,8}, sécrétion hormonale^9,10 et génie génétique des cellules¹¹. Pourtant, les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cellules détecter et répondent aux ultrasons restent floues, excluant la traduction clinique de LIPUS. Donc, dans quelques années, des études des membranes artificielles, des cellules cultivées et des animaux stimulés par des ultrasons ont pris de l’ampleur pour révéler biophysiques et processus physiologiques modulées par LIPUS^{12,13, 14,15}.

Les sons composés d’une vibration se propageant à travers un support physique. Un ultrason est un son avec une fréquence supérieure à la gamme audible humaine (c’est-à-dire supérieures à 20 kHz). Dans un environnement de laboratoire, des ondes ultrasoniques sont généralement fabriqués par des transducteurs piézoélectriques qui contiennent un matériau qui vibre en réponse à un champ électrique oscillant dans une largeur de bande haute fréquence spécifique. Il existe deux types de transducteurs : simple monoéléments et transducteurs. Piézoélectrique monoéléments possèdent une surface courbée qui agit comme une lentille de focalisation et donc se concentre une énergie acoustique dans une région donnée, appelée la zone focale. Monoéléments sont beaucoup moins cher et plus facile à exploiter que les transducteurs. Cet article se concentrera sur monoéléments.

La taille de la zone focale d’un transducteur unique élément dépend des propriétés géométriques de la lentille acoustique et sa fréquence acoustique. Pour atteindre une zone focale millimètre-taille avec un monoélément, fréquences d’ultrasons dans la gamme MHz sont généralement nécessaires. Malheureusement, les ondes acoustiques à une fréquence sont atténués très rapidement lorsque se propageant dans un milieu fragile tel que l’air. Ainsi, des ondes ultrasoniques MHz doivent être générés et propagées à l’échantillon dans un matériau plus dense comme l’eau. Ceci constitue le premier défi en intégrant la modalité LIPUS à un microscope.

Un deuxième défi est de réduire au minimum les interfaces physiques entre les matériaux avec différentes impédances acoustiques (qui est un produit de masse volumique et la vitesse acoustique) le long de la trajectoire acoustique. Ces interfaces peuvent refléter, réfraction, dispersion et absorbent les ondes acoustiques, rendant difficile de quantifier la quantité d’énergie acoustique effectivement livrée à un échantillon. Ils peuvent également créer des objets mécaniques non désirés. Par exemple, les réflexions incompatibilité perpendiculaire à acoustique produit impédance interfaces créent des ondes de backpropagating qui interfèrent avec ceux de multiplication avant. Sur le chemin de l’interférence, les ondes s’annulent mutuellement à des régions fixes des espaces appelés nœuds et résumer en alternant zones appelées anti-noeuds, créant ce que l’on appelle ondes stationnaires (Figure 1). Il est important pour l’expérimentateur d’être en mesure de contrôler ou éliminer ces interfaces expérimentales in vitro comme ils peuvent ne pas exister in vivo.

Mesure de la fluorescence de reporters optiques est une méthode bien connue d’interroger des échantillons biologiques transparents en temps réel et avec aucune perturbation physique. Cette approche est donc idéale pour les études LIPUS car les sondes physiques présents dans la région aux ultrasons présentera des objets mécaniques. Ce protocole décrit la mise en œuvre et le fonctionnement du LIPUS à un microscope épifluorescente commerciale.