Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

Veel ziekten vereist enige vorm van invasieve medische interventie. Deze procedures zijn vaak duur en riskant en vereisen herstel periodes dus het toevoegen van een last aan stelsels voor gezondheidszorg. Niet-invasieve therapeutische modaliteiten hebben het potentieel om veiligere en goedkopere alternatieven voor conventionele chirurgische ingrepen. Huidige niet-invasieve benaderingen zoals farmacotherapie of Transcraniële magnetische stimulatie zijn echter vaak beperkt door afwegingen tussen weefsel penetratie, Spatio resolutie en ongewenste effecten van de af-target. In dit verband vormt een gerichte echografie een veelbelovende niet-invasieve technologie met het potentieel om te manipuleren van de biologische functies diep in de weefsels met hoge Spatio nauwkeurigheid en beperkte af-target effecten.

Gerichte echografie stimulatie bestaat uit het leveren van akoestische energie op exacte locaties diep in levende organismen. Afhankelijk van de akoestische pulse parameters, kan deze energie hebben een verscheidenheid van medische toepassingen. Bijvoorbeeld, heeft de Food and Drug Administration het gebruik van High-intensity geconcentreerd ultrageluid (HiFU) goedgekeurd voor thermische ablatie van tumoren van de prostaat, tremor-veroorzakende hersengebieden, uteriene vleesbomen en zenuwuiteinden pijn veroorzaakt in de botmetastasen¹ . HiFu-gemedieerde microbubble cavitatie wordt ook gebruikt voor Transient openen de bloed – hersen barrière voor de beoogde levering van systemisch bestuurde therapeutics². De ruimtelijke-piek pulse-gemiddelde intensiteit (I_sppa) en de ruimtelijke-piek temporele-gemiddelde intensiteit (ik_{nieuwsagentschap}) gebruikt voor HiFU toepassingen zijn meestal boven verschillende kW cm^-2 en produceren pulse druk van enkele tientallen MPa. Deze intensiteitswaarden zijn ver boven de FDA-goedgekeurde ik_sppa en ik_{nieuwsagentschap} limieten voor diagnostische echografie, 190 W cm^-2 en 720 mW cm^-2, respectievelijk³. In tegenstelling, hebben recente studies aangetoond dat niet-destructieve gepulseerde echografie stimulatie die binnen of in de buurt van het bereik van de plafonds voor de intensiteit diagnostische echografie (LIPUS) kan worden effectief te ver en veilig manipuleren neurale afvuren^{4, 5,6,7,8}, hormonale secretie^9,10 en bioengineered cellen¹¹. Toch zijn de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee cellen voelen en reageren op echografie nog steeds onduidelijk, uitschakeling van klinische vertaling van LIPUS. Vandaar, in de afgelopen jaren onderzoek naar kunstmatige membranen, gekweekte cellen en dieren gestimuleerd met echografie hebben een stroomversnelling te onthullen biofysische en fysiologische processen gemoduleerd door LIPUS^{12,13, 14},^,15.

Geluid bestaat uit een trilling teeltmateriaal via een fysiek medium. Een echografie is een geluid met een frequentie hoger dan de mens hoorbare bereik (i.e., boven 20 kHz). In de omgeving van een laboratorium, zijn ultrasone golven over het algemeen geproduceerd door piëzo-elektrische omvormers die bevatten een materiaal dat naar aanleiding van een elektrisch veld oscillerende in een specifieke bandbreedte van hoge-frequentie trilt. Er bestaan twee soorten omvormers: één element transducers en transducer matrices. Piëzo-elektrische omvormers van één element bezitten een gebogen oppervlak dat fungeert als een focus lens en vandaar concentreert akoestische energie in een bepaald gebied genaamd de focale zone. Enkel element omvormers zijn veel goedkoper en gemakkelijker te bedienen dan transducer matrices. Dit artikel zal zich richten op één element omvormers.

De grootte van de focale zone van een gerichte enkel element transducer hangt af van de geometrische eigenschappen van de akoestische lens en de akoestische frequentie. Om te bereiken een focale millimeter-grootte-zone met een enkel element transducer, zijn ultrasone frequenties in het bereik MHz in het algemeen vereist. Akoestische golven op deze frequentie zijn helaas zeer snel verzwakt wanneer doorgegeven in een ijle medium zoals lucht. Aldus, moeten MHz ultrasone golven worden gegenereerd en doorgegeven aan het monster in een dichtere materiaal zoals water. Dit is de eerste uitdaging bij de integratie van de LIPUS modaliteit aan een microscoop.

Een tweede uitdaging is om te minimaliseren van de fysieke interfaces tussen materialen met verschillende akoestische impedances (dat is een product van materiële dichtheid en de akoestische snelheid) langs het akoestische pad. Deze interfaces kunnen reflecteren, breken, scatter en absorberen van akoestische golven, waardoor het moeilijk te kwantificeren van het bedrag van akoestische energie effectief geleverd aan een monster. Ze kunnen ook ongewenste mechanische artefacten maken. Bijvoorbeeld, maken reflecties geproduceerde loodrecht op akoestische mismatch impedantie interfaces backpropagating golven die met vooruit-teeltmateriaal ones interfereren. De storing weg annuleren de golven elkaar op vaste regio’s van ruimten genaamd knooppunten en samengevat op afwisselende regio’s anti-knooppunten, creëren van zogenaamde staande golven (Figuur 1). Het is belangrijk voor de Vejle te kunnen beheren of elimineren van deze experimentele interfaces in vitro als ze niet in vivo bestaat.

Meting van de fluorescentie van optische verslaggevers is een bekende methode om te ondervragen transparante biologische monsters in real-time en met geen fysieke storingen. Deze aanpak is dus ideaal voor LIPUS studies zoals elke fysieke sondes aanwezig in het sonicated gebied mechanische artefacten introduceren zal. Dit protocol beschrijft de uitvoering en de werking van LIPUS naar een commerciële epi-fluorescentie Microscoop.