Multiplexação focada a estimulação de ultra-som com microscopia de fluorescência

Muitas doenças requerem alguma forma de intervenção médica invasiva. Estes procedimentos são muitas vezes caro, arriscado, requerem períodos de recuperação e, portanto, adicionar um fardo para sistemas de saúde. Modalidades terapêuticas não-invasivos têm potencial para fornecer alternativas mais seguras e mais baratas para procedimentos cirúrgicos convencionais. No entanto, as abordagens atuais não-invasiva como farmacoterapia ou transcraniana estimulação magnética frequentemente são limitadas pelo trade-offs entre a penetração do tecido, spatiotemporal resolução e efeitos indesejados fora do alvo. Neste contexto, um ultrasound focalizado constitui uma tecnologia promissora e não-invasiva com o potencial de manipular funções biológicas dentro de tecidos com alta precisão spatiotemporal e efeitos limitados fora do alvo.

Estimulação do ultrasound focalizado consiste de fornecimento de energia acústica em locais precisos dentro de organismos vivos. Dependendo dos parâmetros de pulso acústico, esta energia pode ter uma variedade de usos médicos. Por exemplo, a Food and Drug Administration aprovou o uso do ultra-som de focado de alta intensidade (HiFU) para ablação térmica de tumores de próstata, regiões do cérebro causando o tremor, miomas uterinos e causando dor de terminações nervosas em metástases ósseas¹ . Mediada por HiFu microbolhas cavitação também é usada para abrir transitoriamente a barreira sangue – cérebro, para a entrega de alvo da terapêutica administrada sistemicamente². A intensidade do pulso-média de pico espacial (eu_sppa) e pico espacial temporal-média intensidade (eu_spta) usado para HiFU aplicações são tipicamente acima vários kW cm^-2 e produzem a pressão de pulso de várias dezenas de MPa. Esses valores de intensidade são muito acima da FDA-aprovado_sppa e eu_spta limites para ultra-som diagnóstico, 190 W cm^-2 e 720 mW cm^-2, respectivamente³. Em contraste, estudos recentes demonstraram que a estimulação não-destrutivos ultra-som pulsado que estão dentro ou perto da gama de limites de intensidade do ultra-som diagnóstico (U.S.P.) pode ser eficaz para remotamente e com segurança manipular neural disparar^{4, 5,6,7,8}, secreção hormonal^9,10 e bioengenharia células¹¹. Ainda, os mecanismos celulares e moleculares pelos quais células detetam e respondem ao ultra-som permanecem pouco claras, impedindo a tradução clínica da U.S.P. Por isso, nos últimos anos, estudos de membranas artificiais, células cultivadas e animais estimulados com ultra-som ganharam ímpeto para revelar biofísicas e processos fisiológicos modulada por U.S.P^{12,13, 14,15}.

Som consiste de uma vibração de propagação através de um meio físico. Um ultra-som é um som com uma frequência acima da faixa audível humana (isto é, acima de 20 kHz). Em um ambiente de laboratório, ondas de ultra-som são geralmente produzidas por transdutores piezoelétricos que contêm um material que vibra em resposta a um campo elétrico oscilando em uma largura de banda alta frequência específica. Existem dois tipos de transdutores: único elemento transdutores e matrizes do transdutor. Transdutores piezoelétricos único elemento possuem uma superfície curva que atua como uma lente de focalização e, portanto, concentra a energia acústica em uma região definida, chamada de zona focal. Transdutores de elemento único são muito mais barato e mais fácil de operar do que matrizes de transdutor. Este artigo irá se concentrar em transdutores de elemento único.

O tamanho da zona focal de um transdutor de elemento único focalizado depende as Propriedades geométricas da lente acústica e sua frequência acústica. Para atingir uma zona focal milímetros-tamanho com um transdutor de elemento único, frequências de ultra-som na faixa de MHz são geralmente necessárias. Infelizmente, ondas acústicas numa frequência tão rapidamente são atenuadas quando propagadas em meio tênue como o ar. Assim, as ondas de ultra-som MHz precisam ser gerado e propagado para a amostra em um material mais denso como água. Este constitui o primeiro desafio em integrar a modalidade U.S.P a um microscópio.

Um segundo desafio é minimizar as interfaces físicas entre materiais com diferentes impedâncias acústicas (que é um produto da densidade do material e a velocidade acústica) ao longo do trajeto acústico. Estas interfaces podem refletir, refratar, dispersão e absorver ondas acústicas, tornando-se difícil de quantificar a quantidade de energia acústica efetivamente entregue a uma amostra. Também podem criar artefatos mecânicos indesejáveis. Por exemplo, interfaces de impedância de incompatibilidade perpendicular ao acústico produzido reflexões criam ondas backpropagating que interferem com os materiais de propagação para a frente. Ao longo do caminho de interferência, as ondas se cancelam mutuamente em regiões fixas de espaços chamados nós e resumir em alternando regiões chamadas antilinfonodos, criando so-called ondas estacionárias (Figura 1). É importante para o experimentalista ser capaz de controlar ou eliminar estas interfaces experimentais em vitro como eles não podem existir em vivo.

Medição de fluorescência de repórteres ópticas é um método conhecido para interrogar amostras biológicas transparentes em tempo real e com nenhum distúrbio físico. Esta abordagem é, portanto, ideal para estudos de U.S.P como qualquer sondas físicas presentes na área lisada irão introduzir artefatos mecânicos. Este protocolo descreve a implementação e operação de U.S.P a um microscópio de fluorescência-epi comercial.