La multiplexación enfocada ultrasonido estimulación con microscopía de fluorescencia

Muchas enfermedades requieren de algún tipo de intervención médica invasiva. Estos procedimientos son a menudo costosas, riesgosas, requieren periodos de recuperación y así añadir una carga a los sistemas de salud. Modalidades terapéuticas no invasivas tienen el potencial para ofrecer alternativas más seguras y más baratas a los procedimientos quirúrgicos convencionales. Sin embargo, actuales no invasivos como la farmacoterapia o transcraneal de la estimulación magnética a menudo están limitados por las compensaciones entre la penetración del tejido, resolución espaciotemporal y efectos no deseados fuera del objetivo. En este contexto, un ultrasonido focalizado constituye una tecnología no invasiva prometedora con el potencial para manipular funciones biológicas en tejidos con alta precisión espacio-temporal y limitados efectos off-target.

Ultrasonido focalizado estimulación consiste en entregar energía acústica en lugares precisos dentro de los organismos vivos. Dependiendo de los parámetros de pulso acústico, esta energía puede tener una variedad de aplicaciones médicas. Por ejemplo, la Food and Drug Administration ha aprobado el uso de ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HiFU) para la ablación térmica de tumores de próstata, regiones del cerebro que causa temblor, fibromas uterinos y las terminaciones nerviosas causando dolor en metástasis óseas¹ . Cavitación HiFu-mediada microburbujas también se utiliza para abrir transitoriamente la barrera blood – brain para la entrega específica de terapéutica administrada sistémicamente². La intensidad de pulso promedio pico espacial (I_sppa) y pico espacial temporal media intensidad (_spta) utilizado para HiFU aplicaciones suelen ser por encima de varios kW cm^-2 y producen la presión de pulso de varias decenas de MPa. Estos valores de intensidad son muy por encima del aprobado por la FDA-_sppa y_spta límites de ultrasonido diagnóstico, 190 W cm^-2 y 720 mW cm^-2, respectivamente³. Por el contrario, estudios recientes han demostrado que el estímulo no destructivo ultrasonido pulsado que están dentro o cerca de la gama de los límites de intensidad de ultrasonido diagnóstico (LIPUS) puede ser eficaz de forma remota y segura manipulación neural disparar^{4, 5,6,7,8}, secreción hormonal^9,10 y Bioingeniería células¹¹. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares por el cual las células sensación y responden al ultrasonido no quedan claros, imposibilitando la traducción clínica de LIPUS. Por lo tanto, en los últimos años, estudios de membranas artificiales, cultivos de células y animales estimulados con ultrasonido han ganado impulso para revelar biofísicos y los procesos fisiológicos modulan por LIPUS^{12,13, 14,15}.

Sonido consiste en una vibración propagación por un medio físico. Un ultrasonido es un sonido con una frecuencia por encima del rango audible humano (es decir, por encima de 20 kHz). En un entorno de laboratorio, ondas de ultrasonido se producen generalmente por transductores piezoeléctricos que contienen un material que vibra en respuesta a un campo eléctrico Oscilante en un determinado ancho de banda de alta frecuencia. Existen dos tipos de transductores: único elemento transductores y arreglos de discos de transductor. Transductores piezoeléctricos individuales poseen una superficie curva que actúa como una lente de enfoque y por lo tanto, se concentra la energía acústica en una región definida llamada la zona focal. Único elemento transductores están mucho más barato y más fácil de utilizar que los arreglos de discos de transductor. Este artículo se centrará en transductores de elemento único.

El tamaño de la zona focal de un transductor de elemento enfocado depende de las propiedades geométricas de la lente acústica y su frecuencia acústica. Para lograr una zona focal de tamaño milimétrico con un transductor de elemento, frecuencias de ultrasonido en el rango de MHz se requiere generalmente. Desafortunadamente, las ondas acústicas en tal frecuencia se atenúan muy rápidamente cuando se propaga en un medio frágil como el aire. Así, las ondas del ultrasonido MHz tiene que ser generado y propagado a la muestra en un material más denso como el agua. Esto constituye el primer desafío de integración de la modalidad LIPUS a un microscopio.

Un segundo desafío es minimizar interfaces físicas entre materiales con diferentes impedancias acústicas (que es un producto de la densidad material y la velocidad acústica) a lo largo de la trayectoria acústica. Estas interfaces se pueden reflejar, refractar, dispersión y absorber las ondas acústicas, lo que hace difícil cuantificar la cantidad de energía acústica efectivamente entregado a una muestra. También pueden crear artefactos mecánicos no deseados. Por ejemplo, reflejos produce desajuste perpendicular al acústico impedancia interfaces crean backpropagating ondas que interfieren con los de propagación hacia adelante. A lo largo de la ruta de interferencia, las olas cancelan mutuamente en regiones fijadas de espacios llamados nodos y resumir en alternando regiones llamadas los nodos, creación de supuesto ondas estacionarias (figura 1). Es importante que el experimentador poder controlar o eliminar estas interfaces experimentales in vitro , que pueden no existir en vivo.

Medida de fluorescencia óptica reporteros es un método bien conocido para interrogar las muestras biológicas transparentes en tiempo real y con ninguna alteración física. Este enfoque por lo tanto es ideal para estudios LIPUS como cualquier sondas físicas presentes en el área de sonicación introducir artefactos mecánicos. Este protocolo describe la implementación y operación de LIPUS a un microscopio de epi-fluorescencia comercial.