Bu iletişim kuralı genel işlemlerini açıklar ve kalite kontrol sağlıklı yetişkin memeli tek hücreleri damlacık-esaslı, yüksek üretilen iş tek hücre RNA-Seq hazırlıkları hazırlanması için gerekli denetler. Sıralama parametreleri, okuma hizalama ve aşağı akım tek hücreli bioinformatic analiz da sağlanır.
Tek hücre gen ekspresyonu doku veya microenvironment içindeki tek tek hücreleri binlerce genelinde analizidir tanımlayıcı hücre kompozisyon, ayrımcılık işlevsel Devletler ve moleküler yolları gözlenen doku temel için değerli bir araç işlevler ve hayvan davranışları. Ancak, sonraki aşağı akım tek hücre moleküler analiz için yetişkin memeli doku sağlam, sağlıklı tek hücre izolasyon zor olabilir. Bu protokol genel işlemlerini açıklar ve yüksek kalite yetişkin tek hücre hazırlıklar sinir sisteminden elde etmek veya bu cilt için gereken sonraki tarafsız tek hücre RNA sıralama ve analiz etkin kalite kontrol eder. Aşağı akım bioinformatic analiz için yönergeler de temin edilmektedir.
Yüksek işlem hacmi tek hücre teknolojisi1,2 ve Kullanıcı dostu biyoinformatik araçlarını son on yılda3üzerinde gelişmeler geliştirilmesi ile yüksek çözünürlüklü gen ifade analizi yeni bir alan ortaya çıkmıştır- tek hücreli RNA sıralama (scRNA-Seq). Tek hücre gen ekspresyonu çalışmanın ilk kök hücre veya kanser hücreleri, heterojen tanımlı hücre popülasyonlarının içinde tanımlamak için ya da ulaşılamaz kullanarak olan nadir hücreleri4,5, olasılığını belirlemek için geliştirilmiştir geleneksel toplu RNA sıralama teknikleri. Bioinformatic araçları kimliği roman alt nüfus (Seurat)2, görselleştirme hücreleri bir psuedotime alanı (tek gözlük)6, tanımı içinde veya arasında nüfus (etkin sinyal ağların boyunca sipariş etkinleştirdiyseniz Doğa Manzaralı)7, tek-hücreleri bir yapay 3B alanda (Seurat ve daha fazlası) Meclisi tahmin8. Bu yeni ve heyecan verici analizler ile bilimsel topluluk için kullanılabilir, scRNA-Seq fast-gen ifade analizi için yeni standart yaklaşım haline geliyor.
ScRNA-Seq büyük potansiyel rağmen temiz bir veri kümesi üretmek ve doğru sonuçlar yorumlamak için gerekli teknik skillsets yeni gelenler için zor olabilir. Burada, temel, ancak kapsamlı bir iletişim kuralı, Bütün birincil dokulara görselleştirme tek hücre izolasyon ve yayın için verilerin sunumunu başlayarak (Şekil 1) sunulmuştur. Farklı dokuların enzimatik sindirim ve sonraki mekanik ayrışma duyarlılık onların derecesine göre değişiklik gibi ilk olarak, sağlıklı tek hücre izolasyon zorlu, kabul edilebilir. Bu iletişim kuralı aşağıdaki yalıtım adımları sağlar ve denetim sürecinde önemli kalite kontrol noktaları tanımlar. İkinci olarak, uyumluluk ve tek hücre teknolojisi ve yeni nesil sıralamanın arasında gereksinimleri anlama kafa karıştırıcı olabilir. Bu iletişim kuralı bir Kullanıcı dostu, damlacık tabanlı tek hücreli barkodlama platform uygulamak ve sıralama gerçekleştirmek için yönergeler sağlar. Son olarak, bilgisayar programlama tek hücreli transcriptomic veri analiz etmek için önemli bir önkoşuldur. Bu iletişim kuralı R programlama dili ile Başlarken kaynaklar sağlar ve iki popüler scRNA Seq özel R paketleri uygulama yönergeler sağlar. Birlikte, bu protokol yapılan açık, yorumlanabilir sonuçları elde etmek için scRNA-Seq analiz işlemlerinde yeni gelenler rehberlik eder. Bu protokolü çoğu dokulara fare ayarlanabilir ve önemlisi insan dokusu da dahil olmak üzere diğer organizmaların kullanılmak üzere değiştirilmiş olabilir. Ayarlamalar bağlı olarak doku ve kullanıcı-ecek var olmak gerekli.
Bu iletişim kuralı aşağıdaki sırada akılda tutulması gereken birkaç önemli noktalar vardır; dahil olmak üzere, 1) tüm kalite kontrol yönergeleri adım 1 ve 2 Bu protokol aşağıdaki doğru Toplam hücresini sayı sayar ( Şekil 2 özetlenen sağlarken kalıcı tek hücre süspansiyon ilgi örnek içindeki tüm hücreleri sağlamak için tavsiye edilir ). Bir kez bu sağlanır ve en iyi duruma getirilmiş koşulların tümü yerine getirilirse, kalite kontrol adımları kesilmesine (için zamandan tasarruf – RNA kalite koruyarak ve azaltılması hücre kaybı). Yüksek canlılık tek hücre ilgi dokusundan başarılı yalıtım onaylayan son derece tavsiye herhangi önce aşağı işliyor. 2) aşırı ayrışma teknikleri bazı hücre tipleri strese diğerlerinden daha duyarlı olduğundan, bu nedenle aşağı akım Analizi semptomlarıdır nüfus, farkında olmadan önyargı. Nazik ayrılma gereksiz hücresel kesme ve sindirim olmadan yüksek hücresel verimleri ve doku kompozisyon bir doğru bir şekilde temsil ulaşmak için önemlidir. Kesme kuvvetleri sırasında toz, FACS ve resuspension adımlar gerçekleşir. 3) olarak herhangi bir RNA çalışma ile bu hazırlık sırasında içine mümkün olduğunca örnek küçük ek RNase tanıtmak en iyisidir. Bu yüksek kaliteli RNA korumak yardımcı olacaktır. Temiz araçlar ve değil herhangi bir donanım için durulama ile ribonükleaz inhibitör çözümleri kullanır RNase free ama DEPC tedavi ürünler kaçının. 4) ürünleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirmek. Bu yüksek kaliteli RNA korumak ve hücre ölümü azaltmak yardımcı olacaktır. Doku diseksiyon uzunluğu ve hayvan sayısı bağlı olarak, aynı anda birden fazla diseksiyonlarının/hazırlıklar başlangıç düşünün. 5) hücreleri buz üzerinde mümkün yüksek kaliteli RNA korumak, hücre ölümü azaltmak ve yavaş hücre zaman sinyal gönderme ve transkripsiyon etkinlik hazırlamak. Gerçi, buz gibi işleme çoğu hücre tipleri için idealdir, bazı hücre türleri (Örneğin, nötrofiller) Oda sıcaklığında işlendiğinde daha iyi performans. 6) kalsiyum, magnezyum, EDTA ve DEPC tedavi ürünleri hücre hazırlık sırasında kaçının.
Bu protokolü nasıl tek hücreler uygun hazırlanması tek hücreleri binlerce transkripsiyon heterojen ortaya çıkarmak ve işlevsel devletler veya bir doku içinde benzersiz hücresel kimlikler ayırımcılık gösterir. Protokol does değil istemek floresan muhabir proteinler veya transgenik araçları ve tek hücre izolasyon için ilgi insanlar de dahil olmak üzere çeşitli dokularda uygulanabilir; Her doku göz önünde bulundurarak benzersizdir ve bu protokol ayarlama/değiştirme bir dereceye gerektirir.
Hücre içinde farklı ve son derece dinamik transkripsiyon programlar tek hücreli genomik değerini vurgulamıştık. Yüksek kaliteli RNA izole bir yana, kaliteli veri kümeleri için gerekli kritik örnek hazırlama adım hücreleri tamamen dokudan serbest bırakılır ve hücreleri sağlıklı ve sağlam olduğunu garanti etmektedir. Bu nispeten düz ön kolayca olan hücreleri toplama, nereye hücreler gevşek korunur, dokularda veya hücreleri dolaşan gibi lenfoid doku gibi serbest bırakmak için olduğunu. Ama bu büyük mesafeler, hücre dışı matriks ve genellikle katı hücre iskeleti proteinleri hücre yapısını korumak dahil çevreleyen kapsayan çok gelişmiş hücresel mimarisi nedeniyle diğer yetişkin dokular için zor olabilir. Hücre dolu serbest bırakmak için bile uygun ayrışma teknikleri ile gerekli titiz ve sık sık uzun işleme mRNA kalite ve hücre bütünlüğü değiştirecek potansiyel yoktur. Buna ek olarak, enzim destekli ayrılma için kullanılan yüksek sıcaklıklar da transkripsiyon imzalar29,30etkiler. İletişim kuralı kalite kontrol sunmak için nasıl en iyi duruma getirme bu engelleri aşmak için yardımcı olabilir göstermek için dokulara myelinated yetişkin sinir ve ekstraselüler matriks zengini yetişkin cilt gibi kullanarak denetler kararlıdır.
Herhangi bir scRNA-Seq deneme tasarlarken büyük göz önünde bulundurarak bir sıralama derinlik seçimdir. Sıralama olabilir son derece multiplexed ve okumak derinliği değişir damla-Seq2 5 milyon kadar okuma/hücre14 akıllı-devamı gibi tam uzunlukta bir RNA-Seq yöntemiyle kullanarak çok düşük olması Çoğu scRNA-Seq deneyler ile sıralama 10.000 okuma/hücre, düşük orta yüksek ifade tutanakları hücre tipi sınıflandırma41,42için genellikle yeterli olduğu algılayabilir. Nerede hücreleri binlerce güvenle nadir nüfus atfetmek için gerekli olabilecek karmaşık dokular arasında nadir hücre popülasyonlarının algılamaya çalışırken sıralama maliyetlerinde tasarruf değerinin sığ sıralama derinliğidir. Ama gen ekspresyonu ve ince transkripsiyon imzaları ile ilişkili işlemler hakkında ayrıntılı bilgi gerekli olduğunda sığ derinlik sıralama yeterli değildir. Şu anda, bu genlerin hücrede büyük çoğunluğu 500.000 okuma/hücre ile tespit edilir ama bu protokol bağlı olarak değişebilir ve doku yazın43,44tahmin edilmektedir. Tam uzunlukta transkript sıralama derleme ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve bu nedenle, roman ya da nadir splice türevleri, tespit edebilen sıralama maliyeti genellikle karmaşık doku sistem oluşan hücreler binlerce incelemek için bu tür yaklaşımlar ölçekleme sınırlayın. Bu protokol için tipik olarak açıklanan olanlar daha düşük karmaşıklık ve sığ sıralama gereksinimi gibi buna ek olarak, 3′ tek hücreli kitaplıkları öğesini. Açıklanan protokolü kullanılarak oluşturulan kitaplıkları beş desteklenen sıralayıcılar birinde sıralı unutmamak gerekir: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 hızlı koşmak ve yüksek çıkış, 4) NextSeq 500/550 ve 5) MiSeq.
Narin doku ve hücre henüz işleme azaltacak alternatif bir yaklaşım tek hücre RNA-Seq, tek hücre RNA-Seq yararlarından bazıları tutar, RNA tek çekirdek45‘ den analizidir. Bu yaklaşım daha hızlı işleme RNA bozulması ve yeterli çekirdek sürümü sağlamak için daha fazla aşırı önlemler azaltmak sağlar ve böylece büyük olasılıkla belirli bir doku içinde tüm hücreleri temsil eden transkripsiyon profilleri daha güvenli bir yakalama sağlar. Bu tabii ki, sadece transkripsiyon etkinlik böylece bu yaklaşım olabilir veya uygun olmayabilir ilgi deneysel hedefleri nelerdir bağlı olarak belirli bir hücrenin içinde mevcut bir bölümünü sağlar.
Belirli bir doku içinde hücresel kimlikleri tam karakterizasyonu yanı sıra, scRNA-Seq veri kümeleri için en değerli analizleri ara Transkripsiyon Birleşik değerlendirilmesi ‘tanımlanmış’ hücre popülasyonlarının biridir. Bu ara devletlerin geleneksel toplu RNA-Seq yaklaşımlar mümkün değildi tanımlanan nüfus içindeki hücreleri arasında soy ilişkileri anlayışlar aktarabilir. Birkaç scRNA Seq bioinformatic araç şimdi bu aydınlatmak için geliştirilmiştir. Gibi araçlar, örneğin, kök hücre içine çeşitli terminal kader ya da bağışıklık hücreleri aktif ve durgun durumlar arasında mekik olgunlaşması bir oncogenic/metastatik durumuna geçiş kanser hücrelerinin dahil süreçleri değerlendirebilirsiniz. Hücreleri ince transcriptome farklılıkları da son zamanlarda geliştirilen bioinformatic araçlar FateID gibi sonucuna göre47lineage önyargıları göstergesi olabilir. Hücreleri geçiş arasında farklar zor olabilir bu yana transkripsiyon farklılıklar tespit için ince olabilir, daha derin sıralama gerekli46olabilir. Neyse ki, kapsamı, derin sıralı bir Kütüphane Kütüphane başka bir akışı cep telefonundan yeniden çalıştırarak veri kümesi daha fazla sondalama ilgilenen varsa artırılabilir.
Birlikte ele alındığında, bu iletişim kuralı transcriptionally tek-hücreleri bir deney içinde binlerce yüzlerce profil kullanıcılarının kullanmasına izin veren bir kolay uyum iş akışı sağlar. ScRNA-Seq dataset nesnesinin son kalite en iyi duruma getirilmiş hücre izolasyon, akış sitometresi, cDNA Kütüphanesi nesil ve ham gen-barkod matrisler yorumlanması dayanmaktadır. Bu amaçla, bu protokol çalışmaları çeşitli doku tipleri etkinleştirmek için kolayca değiştirilebilir tüm anahtar adımların kapsamlı bir genel bakış sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Destek personeli UCDNA Hizmetleri tesisinde, hem de hayvan bakım tesisi personeli University of Calgary anıyoruz. Biz onun Biyoinformatik desteği için Matt Workentine ve Jens Durruthy onun teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser yapıldı (RM ve JB), yanında bir CIHR vermek bir CIHR yeni araştırmacı Ödülü JB ve bir Alberta çocuk sağlığı Araştırma Enstitüsü Bursu (js) finanse.
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |