Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig voor gezonde volwassen één zoogdiercellen voorbereiden druppel gebaseerde, hoge doorvoer eencellige RNA-Seq preparaten. Sequencing parameters, worden Lees uitlijning en downstream eencellige bioinformatic analyse ook geleverd.
De analyse van genexpressie eencellige over duizenden afzonderlijke cellen binnen een weefsel of communicatie is een waardevol instrument voor identificerende cel samenstelling, discriminatie van functionele Staten, en moleculaire pathways onderliggende waargenomen weefsel functies en dierlijke gedrag. Het isolement van intact, gezonde afzonderlijke cellen van volwassen zoogdieren weefsels voor latere downstream eencellige moleculaire analyse kan echter uitdagend. Dit protocol worden de algemene procedures beschreven en kwaliteitscontrole controles nodig te verkrijgen van hoge-kwaliteit volwassen eencellige preparaten van het zenuwstelsel of huid die ingeschakeld latere onbevooroordeelde eencellige RNA sequencing en analyse. Richtsnoeren voor downstream bioinformatic analyse zijn ook beschikbaar.
Met de ontwikkeling van hoge-doorvoer eencellige technologie1,2 en vooruitgang in de gebruiksvriendelijke bioinformatica tools over de laatste tien jaar3, is er een nieuw veld van high-resolution gen expressie analyse naar voren gekomen- eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq). De studie van eencellige genexpressie ontstond eerst identificeren van heterogeniteit binnen de gedefinieerde cel populaties, zoals in stamcellen of kankercellen, of identificeren van zeldzame populaties van cellen4,5, die met behulp van de onbereikbare waren traditionele bulk RNA sequencing technieken. Bioinformatic hulpmiddelen hebt ingeschakeld op de identificatie van nieuwe subpopulatie (Seurat)2, visualisatie van de orde van cellen langs een psuedotime ruimte (Monocle)6, definitie van actieve signalering netwerken binnen of tussen populaties) SCHILDERACHTIGE)7, voorspelling van de vergadering van single-cellen in een kunstmatige 3D-ruimte (Seurat, en meer)8. Met deze nieuwe en opwindende analyses waarover de wetenschappelijke gemeenschap wordt scRNA-Seq fast-de nieuwe standaardbenadering voor gen expressie analyse.
Ondanks het enorme potentieel van scRNA-Seq kunnen de technische vaardigheden nodig is voor het produceren van een schone dataset en nauwkeurig om resultaten te interpreteren uitdagende aan nieuwkomers. Hier, een eenvoudige, maar uitgebreide protocol, vanaf van de isolatie van afzonderlijke cellen van de gehele primaire weefsels naar visualisatie en presentatie van gegevens voor publicatie wordt gepresenteerd (Figuur 1). Ten eerste, het isolement van gezonde enkele cellen kunt geacht uitdagende, verschillende weefsels variëren in de mate van gevoeligheid voor enzymatische spijsvertering en latere mechanische dissociatie. Dit protocol verschaft een leidraad in deze stappen van isolatie en identificeert belangrijke kwaliteitscontrole controlepunten gedurende het gehele proces. Ten tweede, inzicht in de compatibiliteit en eisen tussen eencellige technologie en de volgende generatie sequencing verwarrend kan zijn. Dit protocol biedt richtsnoeren voor de tenuitvoerlegging van een gebruiksvriendelijk, druppel gebaseerde eencellige barcoding platform en volgorde uitvoeren. Ten slotte, computerprogrammering is een belangrijke voorwaarde voor het analyseren van eencellige transcriptomic datasets. Dit protocol voorziet in middelen aan de slag met de programmeertaal R en geeft advies over de uitvoering van twee populaire scRNA-Seq-specifieke R pakketten. Samen kan dit protocol nieuwkomers bij het uitvoeren van scRNA-Seq analyse voor het verkrijgen van heldere, interpreteerbaar resultaten begeleiden. Dit protocol kan worden aangepast aan de meeste weefsels in de muis, en belangrijker kan worden aangepast voor gebruik met andere organismen, met inbegrip van menselijke weefsel. Aanpassingen afhankelijk van het weefsel en de gebruiker zal worden gevraagd.
Er zijn enkele punten waarmee u rekening moet houden terwijl het volgens dit protocol; inclusief 1) naar aanleiding van alle richtsnoeren van de kwaliteitscontrole in stappen 1 en 2 van dit protocol wordt aanbevolen om een levensvatbare interne celsuspensie van alle cellen binnen het monster van belang tegelijkertijd nauwkeurige cel Totaal aantal graven (samengevat in figuur 2 ). Zodra dit gebeurt, en als alle geoptimaliseerde voorwaarden worden gevolgd, de kwaliteitscontrole-stappen kunnen worden afgenomen (aan Bespaar tijd – behoud van RNA kwaliteit en vermindering van de cel verlies). Bevestiging van succesvolle isolatie van hoge levensvatbaarheid afzonderlijke cellen van het weefsel van belang is zeer aan te bevelen voor een stroomafwaarts verwerking. 2) Aangezien sommige celtypen gevoeliger dan anderen zijn te benadrukken, kunnen de bevolking, daarom verstorende downstream analyse per ongeluk vertekening door buitensporige dissociatie technieken. Zachte dissociatie zonder geen onnodige cellulaire schuintrekken en spijsvertering is van cruciaal belang voor het bereiken van hoge cellulaire opbrengsten en een accurate weergave van weefsel samenstelling. Schuintrekken krachten optreden tijdens de verpulvering, FACS en resuspensie stappen. 3) als met een RNA-werk, is het beste te introduceren als weinig extra RNase in het monster mogelijk tijdens de voorbereiding. Dit zal helpen handhaven van kwalitatief hoogwaardige RNA. Gebruiken ribonuclease remmer oplossingen met spoelen gereedschap reinigen en alle apparatuur die niet is RNase-gratis maar DEPC-behandelde producten vermijden. 4) voorbereidingen zo snel mogelijk uitvoeren. Dit zal helpen handhaven van kwalitatief hoogwaardige RNA en celdood te verminderen. Afhankelijk van de lengte van weefsel dissectie en dierlijke nummer, kunt u overwegen meerdere dissecties/voorbereidingen starten op hetzelfde moment. 5) bereiden cellen op ijs wanneer mogelijk te handhaven van hoge kwaliteit RNA, verminderen van celdood, en langzaam cel signalering en transcriptionele activiteit. Alhoewel, ijskoude verwerking is ideaal voor de meeste celtypes, wordt sommige celtypen (b.v., neutrofielen) beter presteren wanneer verwerkt bij kamertemperatuur. 6) Vermijd calcium, magnesium, EDTA en DEPC-behandelde producten tijdens de voorbereiding van de cel.
Dit protocol wordt gedemonstreerd hoe de juiste voorbereiding van afzonderlijke cellen kunt ontdekken de transcriptionele heterogeniteit van duizenden afzonderlijke cellen en discrimineren van functionele Staten of unieke cellulaire identiteiten binnen een weefsel. Het protocol vereist geen fluorescerende verslaggever eiwitten of transgene tools en kan worden toegepast op de isolatie van afzonderlijke cellen van diverse weefsels van belang, met inbegrip van die van de mens; rekening houdend met elk weefsel is uniek en dit protocol vergt een zekere mate van aanpassing/wijziging.
De gevarieerde en hoogdynamische transcriptionele programma’s binnen cellen hebben gewezen op de waarde van één cel genomica. Afgezien van het isoleren van kwalitatief hoogwaardige RNA, een kritische monster voorbereiding stap nodig voor hoge kwaliteit datasets is ervoor te zorgen dat cellen volledig uit weefsel vrijgelaten worden en dat cellen gezond en intact zijn. Dit is relatief ongecompliceerd voor het verzamelen van cellen die gemakkelijk zijn uitgebracht, zoals de circulerende cellen of weefsels waar cellen losjes behouden zijn, zoals lymfoïde weefsels. Maar dit kan uitdagend zijn voor andere volwassen weefsels, vanwege de hoogontwikkelde cellulaire architectuur, verspreid over grote afstanden, omringende extracellulaire matrix en de vaak-stijve cytoskeletal eiwitten die betrokken zijn bij het handhaven van de celstructuur. Zelfs met de juiste dissociatie technieken voor de volledige release van cellen is er potentieel dat de verwerking van het strenge en vaak langdurig vereist mRNA kwaliteit en cel integriteit zou veranderen. Bovendien, de hoge temperaturen gebruikt voor dissociatie van het enzym-bijgewoonde ook invloed op transcriptionele handtekeningen29,30. De bedoeling van het protocol is te presenteren van kwaliteitscontrole controles, met behulp van weefsels zoals de myelinated volwassen zenuw en de extracellulaire matrix-rijke volwassen huid, om aan te tonen hoe optimalisatie kan helpen om deze obstakels te overwinnen.
Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een scRNA-Seq-experiment is de keuze van sequencing diepte. Sequentie kan worden zeer multiplexed en lees diepte kan variëren van zeer lage Drop-Seq2 tot maximaal 5 miljoen leest/cel14 via een full-length RNA-Seq-methode zoals Smart-Seq. gebruikt wordt De meeste scRNA-Seq experimenten kunnen detecteren matige tot hoge expressie chat-kopieën met sequencing zo laag als 10.000 leest/cel, die is meestal voldoende voor cel type indeling41,42. Ondiepe sequencing diepte is van belang om te besparen op sequencing kosten wanneer het proberen om het detecteren van zeldzame cel populaties in complexe weefsels waar duizenden cellen nodig zijn kunnen om vol vertrouwen het toeschrijven van zeldzame populaties. Maar ondiepe diepte rangschikken is niet voldoende wanneer gedetailleerde informatie over de expressie van genen en processen gekoppeld aan subtiele transcriptionele handtekeningen nodig is. Op dit moment geschat wordt dat de grote meerderheid van de genen in een cel worden gedetecteerd met 500.000 leest/cel, maar dit afhankelijk van het protocol variëren kan en weefsel Typ43,44. Terwijl full-length transcript sequencing de noodzaak voor montage omzeilt en daarom roman of zeldzame splice varianten detecteren kan, beperken sequencing kosten vaak schalen van dergelijke benaderingen te onderzoeken van duizenden cellen bestaande uit een complex weefsel systeem. In tegenstelling, 3′ gelabeld eencellige bibliotheken zoals beschreven in dit protocol meestal degenen lagere complexiteit hebben en ondieper sequencing. Het is belangrijk op te merken dat bibliotheken gegenereerd met behulp van het protocol beschreven sequenced kunnen worden op een van de vijf ondersteunde sequencers: 1) NovaSeq 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 snelle Run en hoge Output, 4) NextSeq 500/550 en 5) MiSeq.
Een alternatieve aanpak van eencellige RNA-Seq, dat vermindert de noodzaak voor delicate weefsels en cellen die behandeling nog enkele van de voordelen van eencellige RNA-Seq handhaaft, is de analyse van RNA enkele kernen €45. Deze benadering kunt een snellere verwerking vermindering van de aantasting van het RNA en meer extreme maatregelen om adequate versie van kernen te verzekeren en dus waarschijnlijk voor een zekerder vangst van de transcriptionele profielen vertegenwoordigen alle cellen binnen een bepaald weefsel. Dit zou natuurlijk bieden alleen een gedeelte van de transcriptionele activiteit aanwezig binnen een bepaalde cel, dus afhankelijk van wat de experimentele doelstellingen van belang deze aanpak kan al dan niet geschikt zijn.
Naast de volledige karakterisering van cellulaire identiteiten binnen een bepaald weefsel is een van de meest waardevolle analyses voor scRNA-Seq gegevenssets de beoordeling van tussenliggende transcriptionele Staten over ‘omschreven’ cel populaties. Deze intermediaire Staten kunnen geven inzicht in de bloedlijn relaties tussen cellen binnen geïdentificeerde bevolkingsgroepen, die niet kon met traditionele bulk die RNA-Seq benadert. Diverse scRNA-Seq bioinformatic hulpmiddelen zijn nu ontwikkeld om te verduidelijken dit. Dergelijke instrumenten kunnen beoordelen de processen betrokken bij bijvoorbeeld kankercellen overgang naar een oncogene/metastatische staat, stamcellen rijpen in uiteenlopende terminal lot of immuuncellen pendelen tussen actieve en rustige staten. Subtiele transcriptome verschillen in cellen kunnen ook worden indicatieve van lineage vooroordelen dat onlangs ontwikkelde bioinformatic hulpmiddelen zoals FateID,47kunnen afleiden. Aangezien het onderscheid tussen de overgang van de cellen moeilijk kunnen zijn kunnen om na te gaan gezien de transcriptionele verschillen subtiel, diepere sequencing kan nodig46. Gelukkig kan de dekking van een ondiep gesequenceerd bibliotheek worden verhoogd indien geïnteresseerd in het sonderen van de dataset verder door de bibliotheek opnieuw uit te voeren op een andere cel van de stroom.
Samen genomen, biedt dit protocol een gemakkelijk-aan-adapt workflow waarmee gebruikers transcriptionally profileren honderden tot duizenden single-cellen binnen één experiment. De uiteindelijke kwaliteit van een scRNA-Seq-dataset is afhankelijk van geoptimaliseerde cel isolatie, stroom cytometry, cDNA Bibliotheek generatie en interpretatie van de ruwe gen-barcode matrices. Te dien einde biedt dit protocol een uitgebreid overzicht van alle belangrijke stappen die moeiteloos kunnen worden gewijzigd zodat de studies van verschillende weefseltypes (HLA).
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen het ondersteunend personeel bij de faciliteit van UCDNA diensten, alsmede het personeel van de faciliteit Animal Care aan de Universiteit van Calgary. Wij danken Matt Workentine voor zijn steun van bioinformatica en Jens Durruthy voor zijn technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de CIHR (R.M. en J.B.), een CIHR nieuwe Investigator Award J.B. en een Alberta Children’s Health Research Institute Fellowship (J.S.).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |