פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.
הניתוח של ביטוי גנים תא בודד לאורך אלפי תאים בודדים בתוך רקמות או microenvironment הוא כלי רב ערך עבור מזהה תא הלחנה, אפליה של הברית פונקציונלי, מסלולים מולקולריים שבבסיס נצפתה רקמה פונקציות ואופני בבעלי חיים. עם זאת, בידודו של תאים בודדים שלם, בריא רקמות יונקים בוגרים לבדיקה מולקולרית עוקבות במורד הזרם תא בודד יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללית ובדיקה בקרת איכות הדרושים כדי להשיג תכשירים איכותיים למבוגרים ותא ממערכת העצבים או עור זה זמין הבאים לתא בודד לא משוחד RNA רצף וניתוח. הנחיות ניתוח bioinformatic במורד הזרם הינם גם מסופקים.
עם התפתחות תפוקה גבוהה תא בודד הטכנולוגיה1,2 והתפתחויות ושפור ידידותי למשתמש על פני העשור האחרון3, התפתחה שדה חדש של הביטוי מפענוח ברזולוציה גבוהה – רצפי RNA בתא יחיד (scRNA-Seq). המחקר של ביטוי גנים תא בודד פותחה לראשונה כדי לזהות הטרוגניות בתוך אוכלוסיות תאים מוגדרים, כגון תאי גזע או תאים סרטניים, או כדי לזהות אוכלוסיות נדיר של תאים4,5, אשר היו בלתי ניתנת להשגה באמצעות בתפזורת מסורתי RNA רצף טכניקות. כלים Bioinformatic הפעלת הזיהוי של הרומן תת אוכלוסיות (סרה)2, ויזואליזציה מסדר תאים לאורך psuedotime שטח (המשקף)6, ההגדרה של רשתות איתות פעיל בתוך או בין אוכלוסיות ( נופי)7, חיזוי של ההרכבה של תאי-יחיד בחלל תלת-ממד מלאכותי (סרה ועוד)8. עם אלה חדש ומרגש ניתוחים לרשות הקהילה המדעית, scRNA-Seq הוא מהיר להפוך הגישה החדשה סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים.
למרות הפוטנציאל העצום של scRNA-Seq, טכני מיומנויות הנדרשות כדי לייצר dataset נקי וכדי במדויק לפרש תוצאות יכול להיות מאתגר לחדשים. כאן, פרוטוקול בסיסי, אך מקיף, החל בידודו של תאים בודדים רקמות כל ראשי כדי ויזואליזציה והצגת נתונים לפרסום מוצג (איור 1). ראשית, בידודו של תאים בודדים בריא יכול להיחשב מאתגר, כמו ברקמות שונות להשתנות ב מידת הרגישות עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכני עוקבות. פרוטוקול זה מספק הדרכה בשלבים אלה בידוד ומזהה בקרת איכות חשוב מחסומים לכל אורך התהליך. שנית, הבנת את תאימות ודרישות בין הדור הבא רצפי וטכנולוגיה של תא בודד יכול להיות מבלבל. פרוטוקול זה מספק קווים מנחים כדי ליישם פלטפורמה ידידותי למשתמש, מבוסס-droplet barcoding תא בודד ולבצע רצף. לבסוף, תכנות מחשבים היא תנאי מוקדם חשוב לניתוח נתונים (datasets) transcriptomic תא בודד. פרוטוקול זה מספק מקורות תחילת העבודה עם שפת התיכנות R ומספק הדרכה על יישום שתי חבילות R הפופולרי של scRNA-Seq-ספציפיות. יחד, פרוטוקול זה יכול מדריך במורשתם ביצוע ניתוח scRNA-Seq להשגת תוצאות ברורות, interpretable. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לרקמות רוב העכבר, חשוב יכול להיות שונה לשימוש עם אורגניזמים אחרים, כולל רקמה אנושית. התאמות בהתאם רקמת המשתמש יידרש.
קיימים מספר שיקולים שיש לזכור בעת בעקבות פרוטוקול זה; כולל, 1) בעקבות הנחיות בקרת איכות כל שלבים 1 ו- 2 של פרוטוקול זה מומלץ להבטיח השעיה קיימא תא בודד של כל התאים בתוך המדגם עניין תוך הקפדה על ספירת מספר בתא סכום מדויק (מסוכם ב איור 2 ). פעם זו מושגת, אם כל התנאים ממוטבת עוקבים, אפשר לרדת במדרגות בקרת איכות (כדי לחסוך זמן – שמירה על איכות ה-RNA והפחתת התא הפסד). המאשרת לבידוד מוצלח של תאים בודדים הכדאיות גבוהה מן הרקמה עניין מאוד להמליץ לפני כל במורד הזרם מעבד. 2) מאז כמה סוגי תאים רגישים יותר מאחרים להדגיש, טכניקות דיסוציאציה מופרז יכול בטעות הטיה האוכלוסייה, ולכן משתנה מתערב ניתוח במורד הזרם. דיסוציאציה עדין ללא הטיה הסלולר מיותרים ועיכול חיוני להשגת תפוקה גבוהה הסלולר, ייצוג מדויק של רקמת חיבור. כוחות גזירה להתרחש במהלך השלבים trituration, FACS, resuspension. 3) כמו עם כל עבודה RNA, רצוי להציג בתור RNase נוספים קטן לתוך הדגימה ככל האפשר במהלך ההכנה. זה יעזור לשמור על ה-RNA באיכות גבוהה. להשתמש בפתרונות מעכב ribonuclease עם שטיפה כלים נקיים, כל ציוד שאינו נטול RNase אך להימנע המוצרים שטופלו DEPC. 4) לבצע את ההכנות מהר ככל האפשר. זה יעזור לשמור על ה-RNA באיכות גבוהה ולהפחית את מות תאים. בהתאם אורך חיתוך רקמה חיה מספר, שקול החל והניתוחים/הכנות מרובות בו-זמנית. 5) להכין את התאים על הקרח כאשר אפשרי כדי לשמור על איכות גבוהה RNA, להפחית את מות תאים איטי התא איתות ופעילות גנים ברמת השעתוק. אף על פי, עיבוד קר כקרח הינו אידיאלי עבור רוב סוגי תאים, כמה סוגי תאים (למשל, נויטרופילים) לבצע טוב יותר כאשר מעובד בטמפרטורת החדר. 6) להימנע במהלך ההכנה תא סידן, מגנזיום, EDTA ומוצרים שטופלו DEPC.
פרוטוקול זה מדגים איך ההכנה המתאימה של תאים בודדים אפשר לחשוף את הטרוגניות תעתיק של אלפי תאים בודדים ולא להפלות הברית תפקודית או זהויות ייחודיות סלולר בתוך רקמה. הפרוטוקול אינה דורשת כתב פלורסנט חלבונים או כלים מהונדס, ניתן להחיל את בידודה של תאים בודדים של רקמות שונות כולל אלה של בני אדם; במחשבה כל הרקמה הוא ייחודי, פרוטוקול זה דורש מידה מסוימת של התאמה/שינוי.
התוכניות תעתיק מגוונים ודינאמיים מאוד בתוך התאים הדגישו את הערך של תא בודד גנומיקה. מלבד בידוד איכותי RNA, צעד הכנת דגימה קריטית הדרושות datasets באיכות גבוהה זה להבטיח כי התאים משתחררות לחלוטין מרקמות וכי התאים הם בריאה ושלמה. זה יחסית ישר קדימה עבור איסוף תאים שנמצאים בקלות שוחרר, כגון מחזורי תאים או ברקמות שבו תאים נשמרים באופן רופף, כגון רקמות הלימפה. אבל זה יכול להיות מאתגר בשביל לרקמות אחרות למבוגרים, עקב מפותחים הארכיטקטורה הסלולר המתפרסות על-פני מרחקים גדולים, סביב מטריצה חוץ-תאית, לעיתים קרובות נוקשה cytoskeletal החלבונים המעורבים שמירה על מבנה התא. אפילו עם דיסוציאציה המתאים טכניקות לשחרור מלא של תאים, יש פוטנציאל עיבוד קפדני וממושך לעתים קרובות נדרש לשנות את איכות ה-mRNA ותקינות תא. בנוסף, בטמפרטורות גבוהות המשמש בסיוע אנזימים דיסוציאציה להשפיע גם על חתימות תעתיק29,30. הכוונה של הפרוטוקול היא להציג את בקרת איכות בודק, באמצעות רקמות כגון העצב למבוגרים סיבי העצב ואת העור למבוגרים עשיר מטריצה חוץ-תאית, כדי להדגים איך אופטימיזציה יכול לעזור להתגבר על מכשולים אלה.
שיקול מרכזי בעת עיצוב כל ניסוי scRNA-Seq הוא הבחירה של רצף עומק. רצף ניתן מאוד מרובב ולקרוא לעומק יכול לנוע בין היותו נמוך מאוד באמצעות שחרור-Seq2 עד 5 מיליון קריאות תא14 באמצעות שיטת ה-RNA-Seq באורך מלא כגון Smart-תת סעיף. רוב הניסויים scRNA-Seq יכול לזהות ביטוי בינונית-גבוהה תעתיקים עם רצף המתחילים 10,000 קריאות תא, אשר מספיקה בדרך כלל עבור תא סוג סיווג41,42. רצף רדוד עומק יהיה ערך כדי לחסוך בעלויות רצף כאשר מנסים לגלות אוכלוסיות תאים נדיר מעבר רקמות מורכבות שבו אלפי תאים עשוי להיות נחוץ כדי לייחס בביטחון אוכלוסיות נדיר. אבל עומק רדוד רצף אינה נאותה כאשר מידע מפורט על ביטוי גנים ותהליכים הקשורים חתימות תעתיק עדין הוא הכרחי. נכון לעכשיו, ההערכה היא כי רובם המכריע של הגנים בתא מזוהים עם 500,000 reads/תא, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לפרוטוקול, רקמות הקלד43,44. ואילו רצף באורך מלא התעתיק עוקף את הצורך הרכבה יכול, לפיכך, לזהות הרומן או גרסאות splice נדיר, עלויות רצף מגבילים לעתים קרובות שינוי גודל כזה גישות לבחון אלפי תאים הכוללת מערכת רקמות מורכבות. לעומת זאת, 3′ מתויג תא בודד ספריות כמו אלו המתוארים פרוטוקול זה בדרך כלל יש המורכבות נמוך יותר ודורשים רצף רדודים. חשוב לציין כי היה לסדרם ספריות שנוצר באמצעות פרוטוקול המתואר באחד חמש סקוונסרים הנתמכים: 1) NovaSeq, HiSeq 2) 3000/4000, 3) HiSeq 2500 ריצה מהירה, תפוקה גבוהה, 4) NextSeq 500/550 ו 5) MiSeq.
גישה חלופית לתא בודד RNA-Seq, אשר מפחית את הצורך רקמה עדינה ותא טיפול עדיין שומר על חלק מהיתרונות של תא בודד RNA-Seq, הניתוח של RNA מן הגרעינים יחיד45. גישה זו מאפשרת עיבוד מהירה יותר השפלה RNA, ובמידה יותר באמצעים קיצוניים. כדי להבטיח שחרור נאותה של גרעינים, ומאפשר לפיכך סביר לכידה בטוח יותר מהפרופילים תעתיק המייצגים כל התאים בתוך רקמות נתון. זה, כמובן, רק יספק חלק הפעילות תעתיק מתנה בתוך תא נתון, ולכן תלוי מה מטרות הניסוי הן עניין גישה זו עשויה או לא עשויה להיות המתאים.
מלבד להשלים אפיון זהויות סלולר בתוך רקמות נתון, אחד הניתוחים החשובים ביותר עבור scRNA-Seq datasets הוא ההערכה של הברית תעתיק ביניים על פני אוכלוסיות תא ‘מוגדרת’. מדינות אלה מתווך להקנות תובנות הגומלין שושלת היוחסין בין תאים בתוך אוכלוסיות מזוהה, דבר שלא היה אפשרי עם מסורתיים בצובר ש-RNA-Seq מתקרב. מספר כלים bioinformatic scRNA-Seq עכשיו פותחו כדי להבהיר את זה. כלים כאלה יכולים להעריך את התהליכים המעורבים, לדוגמה, תאים סרטניים מעבר למצב oncogenic גרורתי, תאי גזע הופך מגוונות הגורלות מסוף או תאים חיסוניים בין מדינות השבתה הדרגתית האקטיביות. ההבדלים העדינים transcriptome בתאים יכול להיות גם מעידה על שושלת היוחסין הטיות, כלים שפותחו לאחרונה bioinformatic כמו FateID, ניתן להסיק47. מאז ההבחנות בין העושים מעבר מיגדרי תאים יכול להיות קשה לאמת נתון ההבדלים תעתיק עשויה להיות עדינים, רצף עמוק עשוי להיות נחוץ46. למרבה המזל, ניתן להגדיל את הכיסוי של ספרייה רדודות ברצף אם מעוניינת חיטוט נוסף את ערכת הנתונים על-ידי הפעלה מחדש של הספרייה על תא אחר זרימת.
יחדיו, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קל להסתגל ומאפשר למשתמשים transcriptionally פרופיל מאות עד אלפי חד-תאים בתוך ניסוי אחד. האיכות הסופית של מבנה נתונים scRNA-Seq מסתמך על בידוד תא ממוטבת, cytometry זרימה, דור ספריית cDNA פרשנות של ג’ין raw-ברקוד מטריצות. לשם כך, פרוטוקול זה מספק סקירה מקיפה של כל השלבים החשובים שניתן לשנותו בקלות כדי לאפשר לימודי סוגי רקמות מגוונות.
The authors have nothing to disclose.
אנו להכיר את צוות התמיכה במתקן שירותי UCDNA, כמו גם צוות המתקן חיה טיפול מאוניברסיטת קלגרי. אנו מודים מאט Workentine בשל תמיכתו ביואינפורמטיקה, ג’נס Durruthy לתמיכה טכנית שלו. עבודה זו היה ממומן על ידי מענק CIHR (חומרי גלם, ג’יי-בי), פרס חוקר חדש CIHR מאד, בריאות מחקר מכון אחווה (י. ס אלברטה לילדים).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |