Questo protocollo descrive le procedure generali e controlli di qualità necessari per la preparazione di cellule singole mammifera adulte sane per le preparazioni di RNA-Seq unicellulare gocciolina-based, alta velocità di trasmissione. Parametri di sequenziazione, leggi l’allineamento e l’analisi bioinformatica di cella singola a valle sono inoltre forniti.
L’analisi dell’espressione genica di singola cellula attraverso migliaia di singole celle all’interno di un tessuto o un microambiente è un prezioso strumento per l’identificazione delle cellule composizione, discriminazione degli stati funzionali e vie molecolari che sono alla base del tessuto osservato funzioni e comportamenti degli animali. Tuttavia, l’isolamento di cellule singole intatte, sane da tessuti di mammiferi adulti per l’analisi molecolare successiva cella singola a valle può essere impegnativo. Questo protocollo descrive le procedure generali e controlli di qualità necessario per ottenere preparazioni di cellule singole adulto di alta qualità dal sistema nervoso o della pelle che è stato attivato analisi e sequenziamento di successive imparziale singola cella RNA. A vostra disposizione anche linee guida per l’analisi bioinformatica e a valle.
Con lo sviluppo di elevato throughput unicellulare tecnologia1,2 e gli avanzamenti in strumenti di bioinformatica user-friendly nel corso degli ultimi dieci anni3, è emerso un nuovo campo di analisi di espressione genica ad alta risoluzione – sequenziamento di RNA di singola cellula (scRNA-Seq). Lo studio dell’espressione genica singola cella è stato sviluppato per identificare eterogeneità all’interno di popolazioni di cellule definito, come in cellule staminali o cellule tumorali, o per identificare rare popolazioni di cellule4,5, che erano irraggiungibili utilizzando tecniche di sequenziamento di RNA tradizionale alla rinfusa. Strumenti di Bioinformatic hanno permesso l’identificazione di sub-popolazioni romanzo (Seurat)2, visualizzazione dell’ordine di cellule lungo un psuedotime spazio (monocolo)6, definizione delle reti di segnalazione attive all’interno o tra popolazioni ( SCENIC)7, la previsione dell’Assemblea del singolo-cellule in uno spazio 3D artificiale (Seurat e più)8. Con queste nuove e interessanti analisi disponibili alla comunità scientifica, scRNA-Seq è rapidamente diventando il nuovo approccio standard per l’analisi dell’espressione genica.
Nonostante il vasto potenziale della scRNA-Seq, la skillsets tecnica necessaria per produrre un set di dati puliti e interpretare con precisione i risultati può essere difficile per i nuovi arrivati. Qui, un protocollo semplice, ma completo, a partire dall’isolamento di singole cellule da tessuti intero primari per visualizzazione e presentazione dei dati per la pubblicazione è presentato (Figura 1). In primo luogo, l’isolamento di singole cellule sane possa essere considerato impegnativo, come tessuti differenti variano nel loro grado di sensibilità alla digestione enzimatica e successiva dissociazione meccanica. Questo protocollo fornisce una guida nella procedura di isolamento e identifica i checkpoint importante controllo di qualità durante tutto il processo. In secondo luogo, comprendere la compatibilità e requisiti tra tecnologia single cell e sequenziamento di nuova generazione può essere confusa. Questo protocollo fornisce linee guida per implementare una piattaforma facile da usare, basato su goccia unicellulare codici a barre ed eseguire l’ordinamento. Infine, programmazione di computer è un presupposto importante per l’analisi unicellulare Transcrittomica DataSet. Questo protocollo fornisce risorse per iniziare a utilizzare il linguaggio di programmazione R e fornisce indicazioni sull’implementazione di due popolari pacchetti di R scRNA-Seq-specifici. Insieme, questo protocollo può guidare i nuovi arrivati in esecuzione di analisi scRNA-Seq per l’ottenimento di risultati chiari e interpretabili. Questo protocollo può essere registrato alla maggior parte dei tessuti nel topo e cosa importante potrebbe essere modificato per l’utilizzo con altri organismi, compresi tessuti umani. Regolazioni a seconda del tessuto e l’utente sarà richieste.
Esistono alcune considerazioni da tenere a mente mentre a seguito di questo protocollo; compreso, 1) a seguito di tutte le linee guida di controllo di qualità nei passaggi 1 e 2 del presente protocollo è consigliato per garantire una sospensione di cellule singole vitali di tutte le cellule all’interno del campione di interesse assicurando numero conta accurata e totale delle cellule (riassunti in Figura 2 ). Una volta che questo è realizzato, e se vengono rispettate tutte le condizioni ottimizzate, la procedura di controllo di qualità può essere eliminata (per risparmiare tempo – preservando la qualità di RNA e riducendo cella perdita). Confermando il successo isolamento di singole cellule di alta redditività dal tessuto di interesse è altamente consigliato a valle prima di qualsiasi elaborazione. 2) dato che alcuni tipi di cellule sono più sensibili di altre allo stress, tecniche di dissociazione eccessivo possono inavvertitamente pregiudizi la popolazione, quindi confusione dell’analisi a valle. Dissociazione dolce senza inutili tosatura cellulare e digestione è fondamentale per il raggiungimento di alti rendimenti cellulari e una rappresentazione accurata della composizione del tessuto. Le forze di taglio si verificano durante le operazioni di triturazione, FACS e risospensione. 3) come con qualsiasi altra attività di RNA, è meglio introdurre come little RNasi aggiuntiva nel campione come possibile durante la preparazione. Questo aiuterà a mantenere alta qualità RNA. Utilizzare soluzioni di inibitore della ribonucleasi con risciacquo per attrezzi puliti e qualsiasi apparecchiatura che non sia RNAsi-libera ma evitare prodotti trattati con DEPC. 4) eseguire preparazioni più rapidamente possibile. Questo vi aiuterà a mantenere alta qualità RNA e ridurre la morte delle cellule. A seconda della lunghezza di dissezione dei tessuti e numero degli animali, è consigliabile iniziare dissezioni/preparazioni multiple allo stesso tempo. 5) preparare cellule su ghiaccio quando possibile per mantenere alta qualità RNA, ridurre la morte delle cellule e lento attività trascrizionale e segnalazione delle cellule. Seppur, elaborazione ghiacciata è ideale per la maggior parte delle cellule, alcuni tipi di cellule (per esempio, neutrofili) siano migliori quando trattati a temperatura ambiente. 6) evitare di calcio, magnesio, EDTA e prodotti trattati con DEPC durante la preparazione delle cellule.
Questo protocollo dimostra come la corretta preparazione delle singole cellule possa scoprire l’eterogeneità trascrizionale di migliaia di singole cellule e discriminare gli stati funzionali o identità univoche cellulare all’interno di un tessuto. Il protocollo non richiede proteine reporter fluorescenti o strumenti transgenici e può essere applicato per l’isolamento di singole cellule da vari tessuti di interesse compresi quelli dagli esseri umani; tenendo in considerazione ogni tessuto è unico e questo protocollo richiederà un certo grado di regolazione/modifica.
I programmi trascrizionali vari e altamente dinamici all’interno delle cellule hanno sottolineato il valore della cella singola genomica. Oltre a isolamento di RNA di alta qualità, una fase di preparazione del campione critici necessaria per i set di dati di alta qualità è garantire che le cellule sono completamente liberate dal tessuto e che le cellule sono sane e intatte. Questo è relativamente semplice per raccolta di cellule che sono facilmente rilasciato, come cellule circolanti o nei tessuti dove le cellule senza bloccare vengono mantenute, come nei tessuti linfoidi. Ma questo può essere difficile per altri tessuti dell’adulto, a causa dell’architettura cellulare altamente sviluppata che coprono grandi distanze, matrice extracellulare e le proteine citoscheletriche rigida spesso coinvolti nel mantenimento della struttura delle cellule circostanti. Anche con tecniche di dissociazione appropriato per la versione completa di cellule, esiste la possibilità che l’elaborazione rigorosa e spesso lunga richiesta avrebbe alterato l’integrità delle cellule e di qualità di mRNA. Inoltre, le temperature elevate utilizzate per dissociazione enzima-assistita anche sui transcriptional firme29,30. L’intento del protocollo è di presentare il controllo di qualità controlla, usando tessuti quali il nervo myelinated adulto e pelle adulta ricchi di matrice extracellulare, per dimostrare come ottimizzazione può aiutare a superare questi ostacoli.
Una considerazione importante quando si progetta qualsiasi esperimento scRNA-Seq è la scelta della profondità di sequenziamento. L’ordinamento può essere altamente multiplexato e leggere profondità può variare da essere molto basso facendo uso di goccia-Seq2 a fino a 5 milioni di letture/cella14 utilizzando un metodo di RNA-Seq full-length come Smart-Seq. Maggior parte degli esperimenti di scRNA-Seq può rilevare trascrizioni moderata-alta espressione con sequenziamento à partir 10.000 letture/cella, che è solitamente sufficiente per cella tipo classificazione41,42. Profondità poco profonda sequenziamento è di valore per risparmiare sui costi di sequenziamento in quando si cerca di rilevare popolazioni di cellule rare attraverso tessuti complessi dove migliaia di cellule può essere necessario attribuire con fiducia popolazioni rare. Ma sequenziamento di profondità non è adeguata quando informazioni dettagliate sull’espressione genica e processi associati con sottile transcriptional firme sono necessari. Attualmente, si stima che la grande maggioranza dei geni in una cella vengono rilevata con 500.000 letture/cella, ma questo può variare a seconda del protocollo e tessuto tipo43,44. Mentre trascrizione integrale sequenziamento aggira la necessità per l’assemblaggio e può, pertanto, rilevare romanzo o varianti di splicing rara, costi di sequenziamento spesso limitano tali approcci per esaminare migliaia di cellule che compongono un sistema complesso tessuto di ridimensionamento. Al contrario, 3′ etichetta singola cellula librerie come quelli descritti nel presente protocollo in genere hanno una minore complessità e richiedono meno profonda sequenziamento. È importante notare che le librerie generate utilizzando il protocollo descritto possono essere sequenziate su uno dei cinque sequencer supportati: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 esecuzione rapida e ad alto rendimento, 4) NextSeq 500/550 e 5) MiSeq.
Un approccio alternativo a singola cella RNA-Seq, che riduce la necessità di tessuti delicati e manipolazione ancora celle mantiene alcuni dei vantaggi della singola cella RNA-Seq, è l’analisi del RNA da singoli nuclei45. Questo approccio permette l’elaborazione più rapida, riducendo la degradazione di RNA e altre misure estreme per garantire adeguata rilascio dei nuclei e così probabilmente consente un’acquisizione più sicura dei profili trascrizionali che rappresenta tutte le celle all’interno di un dato tessuto. Questo sarebbe, naturalmente, fornire solo una parte dell’attività trascrizionale presente all’interno di una cella specificata, quindi a seconda di quali sono gli obiettivi sperimentali di interesse questo approccio potrebbe o potrebbe non essere appropriato.
Oltre alla caratterizzazione completa delle identità cellulare all’interno di un dato tessuto, una delle analisi più preziosi per i DataSet scRNA-Seq è la valutazione di stati intermedi trascrizionale attraverso le popolazioni ‘definito’ delle cellule. Questi stati intermedi possono impartire le relazioni di discendenza tra le celle all’interno di popolazioni identificati, che non era possibile con tradizionale alla rinfusa che si avvicina a RNA-Seq: intuizioni. Diversi strumenti di bioinformatic scRNA-Seq ora sono stati sviluppati per delucidare questo. Tali strumenti possono valutare i processi coinvolti in, ad esempio, le cellule tumorali transizione a uno stato di oncogeni e/o metastatico, cellule staminali, maturando in diversi destini terminali o cellule immunitarie spola tra Stati attivi e quiescenti. Transcriptome sottili differenze nelle cellule possono anche essere indicative delle polarizzazioni di lignaggio che, strumenti bioinformatici sviluppati di recente come FateID, in grado di dedurre47. Poiché le distinzioni tra cellule di transizione possono essere difficile accertare dato le differenze trascrizionale possono essere sottili, sequenziamento più profonda può essere necessario46. Fortunatamente, copertura di una libreria che digrada dolcemente in sequenza può essere aumentata se siete interessati a sondare il dataset ulteriormente rieseguendo la libreria su un’altra cella di flusso.
Presi insieme, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile adattare che consente agli utenti di profilo trascrizionalmente centinaia o migliaia di single-celle all’interno di un esperimento. La qualità finale di un dataset scRNA-Seq si basa sull’isolamento delle cellule ottimizzato, citometria a flusso, generazione della libreria di cDNA e interpretazione del codice a barre-gene crudo matrici. A tal fine, questo protocollo fornisce una panoramica completa di tutti i passaggi chiave che possono essere facilmente modificati per attivare studi di tipi di tessuti diversi.
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo che il personale di supporto presso l’impianto di servizi UCDNA, così come il personale della struttura Animal Care presso l’Università di Calgary. Grazie a Matt Workentine per il suo sostegno di bioinformatica e Jens Durruthy per il suo supporto tecnico. Quest’opera è stata finanziata da una sovvenzione CIHR (R.M. e J.B.), un CIHR nuovo Investigator Award a J.B. e Health Research Institute Fellowship (J.S. bambini all’Alberta).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |