Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri
Summary
RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.
Abstract
Uzun yıllar boyunca, biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü ve hızlı bir şekilde biçimlendirilmiş etkileşim başarılı bir şekilde biyolojik olarak önemli RNA/protein kompleksleri kısmi saflaştırılması için kullanılmıştır. Ancak, bu strateji daha geniş kullanımı sınırlayan bir büyük dezavantaj muzdarip: biotin/streptavidin etkileşimi sadece denaturing de bu nedenle iyileştirmelerden eluted kompleksleri bütünlüğünü bozmaya koşullar altında bölünebilecek onların sonraki fonksiyonel analiz ve/veya diğer yöntemlerle daha fazla arıtma. Buna ek olarak, eluted örnekleri sık sık streptavidin boncuklar, gümüş boyama ve kütle spektrometresi tarafından arıtılmış kompleksleri analizini komplike nonspecifically ilişkilendirmek arka plan proteinler ile kontamine. Biotin/streptavidin strateji biotin bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı üzerinden bir RNA substrat eklenen ve streptavidin boncuk üzerinde immobilize kompleksleri seçerek çözüm için eluted bir türevi geliştirdiğimiz bu sınırlamalarını aşmak için bir yerli forma göre uzun dalga UV, arka plan proteinlerin üstündeki bırakarak. Daha uzun RNA yüzeylerde iki grup ile tamamlayıcı oligonükleotid tarafından sağlanabilir, ancak daha kısa RNA bağlama yüzeylerde kimyasal olarak biotin ve kovalent bağlı 5′ ucuna RNA, fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ile sentezlenmiş. UV-elüsyon yöntemi bu iki çeşidini histon pre-mRNA’ların 3′ sonunda ayırmak U7 snRNP bağımlı işleme kompleksleri arınma için test edildi ve olumlu diğerine daha önce karşılaştırmak için arıtma yöntemleri geliştirilmiş ispatlayamadılar. UV eluted örnekleri büyük protein kirletici içermez ve fonksiyonel deneyleri ve kütle spektrometresi ile doğrudan analiz için uygun U7 snRNP kolayca saptanabilir miktarda yer. Açıklanan yöntemi kolayca diğer RNA bağlama kompleksleri arıtma için uyarlanmış ve DNA-spesifik proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri arındırmak için tek ve çift iplikçikli DNA bağlayıcı siteleri ile birlikte kullanılır.
Introduction
Ökaryotlarda RNA polimeraz II tarafından oluşturulan mRNA öncüleri (pre-mRNA) çekirdek birkaç olgunlaşma olayları sitoplazmada protein sentezi için tamamen işlevsel mRNA şablonlar olmadan önce tabi. Bu olaylar, 3′ uç işleme biridir. Pre-mRNA’ların büyük çoğunluğu için 3′ uç işleme için Poliadenilasyon birleştiğinde bölünme içerir. Bu iki aşamalı reaksiyon nispeten bol kompleksi tarafından katalizlenir 15’ten fazla protein1/ oluşan. Hayvan çoğaltma bağımlı histon pre-mRNA’ların 3′ sonunda göre U7 snRNP, düşük bereket U7 snRNA ~ 60 nukleotid ve birden fazla protein2,3 oluşan karmaşık kilit rol oynadı farklı bir mekanizma tarafından işlenir . U7 snRNA baz çifti ile histon pre-mRNA ve U7 snRNP alt birimleri biri belirli bir sırada tromboksan bölünme tepki, Olgun histon üreten mRNA olmadan bir poli(a) kuyruğu. histon pre-mRNA son işlem 3′ de sap-ilmik bağlayıcı Protein (korunmuş bir sap-ilmik bulunan bağlayan SLBP), gerektirdiği bölünme sitesinin ters yönde ve U7 snRNP substrat2,3istihdamı artırır. U7 snRNP tek tek bileşenlerini tanımlayan amaçlayan çalışmalar U7 snRNP hayvan hücrelerinde düşük konsantrasyon ve ayırmak veya kısmi proteolizis kullanarak bir sonucu olarak arıtma sırasında geçmesi için karmaşık eğilimi nedeniyle zorlu olmuştur Hafif Deterjan4,5,6, yüksek tuz yıkar ve/veya birden fazla kromatografik adımları7,8,9
Son zamanlarda, U7-bağımlı işleme makineleri kompozisyonu belirlemek için kısa bir parçası histon pre-mRNA içeren biotin 3′ ya veya 5′ nükleer bir özü ile inkübe ve birleştirilmiş kompleksleri streptavidin kaplı üzerinde ele geçirildi Özel boncuk5,6,10. Biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü etkileşim nedeniyle streptavidin boncuk üzerinde immobilize proteinler koşullar altında denaturing içinde SDS kaynatılarak eluted ve gümüş boyama ve kütle spektrometresi tarafından analiz etti. Bu basit yaklaşım U7 snRNP bileşenleri bir dizi tespit ederken, genellikle çok sayıda potansiyel olarak bazı bileşenleri maskeleme streptavidin boncuk için nonspecifically bağlı arka plan proteinler ile kirlenmiş nispeten ham örnekleri vermiştir işleme makineleri ve gümüş onların algılamayı engelliyor jelleri5,6,10lekeli. Önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda herhangi bir fonksiyonel çalışmalar izole malzeme ve homojenliği için daha fazla onun arıtma ile ek yöntemler tarafından durdurulmasını emretti.
Biotin/streptavidin etkileşimi, etkileşimi de zayıflamaya veya kimyasal olarak yarilabilir spacer kolundan sağlamak için tasarlanmış olan çoğu hemen hemen geri dönüşü olmayan doğa yönelik olarak zaman içinde değişiklikler bir dizi teklif edildi biotin içeren reaktifler11,12. Tüm bu değişiklikler olumsuz önemli ölçüde bütünlüğü veya etkinlik arıtılmış proteinlerin tehlikeye elüsyon adımı sırasında Yöntem ve/veya sık sık gerekli fizyolojik olmayan şartlarda verimliliğini azaltmak oldu.
Burada, içsel sorun gidermek için farklı bir yaklaşım tarif RNA kullanarak biotin/streptavidin stratejisinin yüzeylerde içinde biotin kovalent bağlı 5′ üzerinden bir fotoğraf yarilabilir 1-(2-nitrophenyl) son olduğunu etil yan duyarlı uzun dalga UV13,14. Drosophila bu yaklaşımdan sınırlayıcı U7-bağımlı işleme makineleri arıtma için test ettik ve15memeli nükleer ayıklar. Histon pre-mRNA içeren biotin kısa kuluçka nükleer bir özü ile fotoğraf yarilabilir bağlayıcı, birleştirilmiş işlem kompleksleri streptavidin boncuk üzerinde immobilize, iyice yıkanmış ve yavaşça bir yerli çözüm için serbest form tarafından ~ 360 nm UV ışığa maruz kalma. UV-elüsyon çok verimli, hızlı ve doğru sözlü, U7 snRNP özü15kadar az 100 µL boyama gümüş tarafından bileşenlerinden görselleştirmek için yeterli miktarda verimli yöntemdir. UV eluted ücretsiz arka plan proteinlerin ve doğrudan kütle spektrometresi analizi, ek arıtma adımları ve enzimatik deneyleri için uygun bir malzemedir. Yöntemin kısa RNA bağlayıcı siteleri gerektiren diğer RNA/protein kompleksleri arıtma için kabul edilebilir. Biotin ve fotoğraf yarilabilir bağlayıcı da kovalent için tek – ve çift iplikçikli DNA, potansiyel olarak çeşitli DNA/protein kompleksleri arıtma için UV-elüsyon yöntemi uzanan iliştirilebilir.
Kovalent içeren RNA yüzeylerde kimyasal sentez biotin bağlı ve fotoğraf yarilabilir bağlayıcı pahalı ve verimsiz önemli ölçüde uzun serileri için sadece ~ 65 nükleotit, fazla olamaz sıralarıyla pratik oluyor. Bu sorunu çözmek için Ayrıca daha fazla RNA bağlayıcı hedefler için uygun olan alternatif bir yaklaşım geliştirmiştir. Bu yaklaşımda, RNA herhangi bir uzunluk ve nükleotid sırası T7 veya SP6 transkripsiyon tarafından oluşturulan vitro olduğunu ve kısa bir tamamlayıcı oligonükleotid komplementer biotin ve sonunda 5′ (trans fotoğraf yarilabilir bağlayıcı içeren yapılandırma). Sonuç çift yönlü daha sonra bireysel proteinler veya makromoleküllerin kompleksleri streptavidin boncuk kovalent bağlı fotoğraf yarilabilir biotin içeren RNA yüzeyler için açıklanan aynı protokol sonrası üzerinde arındırmak için kullanılır (CIS yapılandırma). Bu değişiklik ile fotoğraf yarilabilir biotin, nükleotit, UV-elüsyon yöntemi, bir geniş aralığı RNA/protein arıtma uzanan yüzlerce içeren oluşturulan vitro tutanaklar ile birlikte kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada anlatılan yöntem basit ve bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ekleme yanı sıra ve UV-elüsyon adım biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü etkileşim yararlanmak sık kullanılan yöntemlerden farklı değildir. UV-elüsyon adım çok etkilidir, genellikle immobilize RNA % 75’den fazla serbest ve streptavidin boncuklar, boncuklar için özel olarak sigara bağlayan proteinler yüksek bir arka plan geride bırakarak gelen proteinler ilişkili. Bu arka plan ortadan kaldırarak, UV-elüsyon adım…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bizim iş için bizim meslektaşları ve işbirlikçileri katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIH tarafından desteklenen GM 29832 verin.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d’Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3′ end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 ‘-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 ‘-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2′- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 ‘-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5′-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ‘ exonuclease that specifically interacts with the 3 ‘ end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3’hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3’hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3′ end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ‘ end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3′ processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L’Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3′ end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
