Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt
Summary
RNA/Proteinkomplexe gereinigt mit Botin Streptavidin-Strategie sind Lösung unter denaturierenden Bedingungen in einer Form ungeeignet für die weitere Reinigung und Funktionsanalyse eluiert. Hier beschreiben wir eine Änderung dieser Strategie, die einen Foto-spaltbaren Linker in RNA und einem sanften UV-Elution Schritt nachgeben native und voll funktionsfähige RNA/Proteinkomplexe nutzt.
Abstract
Seit vielen Jahren ist die außergewöhnlich starke und rasch gebildete Interaktion zwischen Biotin und Streptavidin erfolgreich für die partielle Reinigung der biologisch wichtigen RNA/Proteinkomplexe verwendet worden. Diese Strategie leidet jedoch einen großen Nachteil, die die breitere Nutzung begrenzt: die Biotin/Streptavidin-Interaktion kann gebrochen werden, nur unter denaturierenden Bedingungen, die die Integrität der eluierten komplexe, so dass auch stören ihre anschließenden Funktionsanalyse und/oder weitere Reinigung durch andere Methoden. Darüber hinaus sind die eluierten Proben häufig mit Hintergrund-Proteine verunreinigt, die nonspecifically mit Streptavidin-Perlen, erschwert die Analyse der gereinigten komplexe durch silberne Färbung und Massenspektrometrie zuordnen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir eine Variante der Biotin/Streptavidin-Strategie in dem Biotin ist eine RNA-Substrat über einen Foto-spaltbaren Linker angebracht und die komplexe an Streptavidin Perlen immobilisiert sind selektiv eluiert Lösung in einer nativen Form durch langwellige UV, so dass die Hintergrund-Proteine auf die Perlen. Kürzere RNA bindenden Substraten können chemisch mit Biotin und der Foto-spaltbaren Linker kovalent an das 5′-Ende der RNA angeschlossen synthetisiert werden, während längeren RNA Substrate mit den beiden Gruppen von komplementären Oligonukleotids bereitgestellt werden können. Diese beiden Varianten der UV-Elution Methode zur Reinigung der U7 SnRNP-abhängige Verarbeitung komplexe, die Histone Pre-mRNAs am 3′-Ende cleave getestet wurden und beide bewiesen, günstig im Vergleich zu anderen zuvor Reinigungsverfahren entwickelt. Die UV-eluiert Proben enthalten leicht nachweisbare Mengen an der U7-SnRNP, die frei von großen Protein Verunreinigungen und geeignet für die direkte Analyse von Massenspektrometrie und funktionelle Assays wurde. Das beschriebene Verfahren kann leicht für die Reinigung der andere RNA-bindende komplexe angepasst und verwendet in Verbindung mit Einzel- und Doppelstrang-DNA-Bindungsstellen zur Reinigung von DNA-spezifische Proteine und makromolekulare komplexe.
Introduction
In den Eukaryotes unterzogen RNA-Polymerase II-generierte mRNA Vorstufen (Pre-mRNAs) mehrere Reifung Ereignissen im Zellkern vor immer voll funktionsfähige mRNA-Vorlagen für die Proteinsynthese im Zytoplasma. Eines dieser Ereignisse ist 3′ End-Verarbeitung. Für die überwiegende Mehrheit der Pre-mRNAs umfasst 3′ Ende Verarbeitung Spaltung an Polyadenylation gekoppelt. Diese zweistufige Reaktion ist katalysiert durch ein relativ reichlich Komplex bestehend aus mehr als 15 Proteine1. Tier-Replikation-abhängige Histon Pre-mRNAs werden am 3′-Ende durch einen anderen Mechanismus verarbeitet in denen die Schlüsselrolle von U7 SnRNP, eine niedrige Fülle Komplex bestehend aus U7 SnRNA ~ 60 Nukleotide und mehrere Proteine2,3 gespielt wird . Die U7 SnRNA Basenpaare mit einer bestimmten Reihenfolge in Histon Pre-mRNA und eine der Untereinheiten der U7 SnRNP katalysiert die Spaltung Reaktion, Generierung von Reifen Histon mRNA ohne eine poly(A) tail. 3′ End-Verarbeitung von Histon Pre-mRNA erfordert auch Stem-Loop Binding Protein (SLBP), die eine erhaltene Stamm-Schleife befindet sich bindet die Spaltstelle stromaufwärts und fördert die Einstellung von der U7 SnRNP Substrat2,3. Studien zur Identifizierung einzelner Komponenten der U7-SnRNP wurden durch die geringe Konzentration von U7-SnRNP in tierischen Zellen und die Tendenz des Komplexes zu distanzieren oder teilweise Proteolyse zu unterziehen, während der Reinigung durch den Einsatz von anspruchsvoll Feinwaschmittel4,5,6, hohe Salz wäscht und/oder mehrere chromatographische Schritte7,8,9.
Vor kurzem, um die Zusammensetzung der U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen zu ermitteln, wurde ein kurzes Fragment von Histon Pre-mRNA enthält Biotin auf 3′ oder 5′ mit einem nuklearen Extrakt inkubiert und die montierten Anlagen wurden gefangen genommen, auf Streptavidin beschichteten Agarose Korne5,6,10. Aufgrund der außergewöhnlich starken Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin Proteine auf Streptavidin Perlen immobilisiert eluiert unter denaturierenden Bedingungen durch Kochen in SDS und durch silberne Färbung und Massenspektrometrie analysiert. Während diesem einfache Ansatz eine Reihe von Komponenten der U7 SnRNP identifiziert, ergab es relativ primitiven Proben, oft mit einer großen Anzahl von Hintergrund-Proteinen nonspecifically verpflichtet Streptavidin Perlen, möglicherweise einige Komponenten der Maskierung kontaminiert die Verarbeitungsmaschinen und verhindern, dass ihre Erkennung auf Silber gefärbt Gele5,6,10. Wichtig ist, diesen Ansatz ausgeschlossen auch funktionellen Studien mit dem isolierten Material und dessen weitere Reinigung zur Homogenität durch zusätzliche Methoden.
Eine Reihe von Änderungen wurden vorgeschlagen, im Laufe der Zeit an die praktisch Unumkehrbarkeit Biotin/Streptavidin-Interaktion, die meisten davon entwerfend, entweder die Interaktion zu schwächen oder zu einem chemisch spaltbaren Abstandhalter Arm in die Biotin-haltigen Reagenzien11,12. Der Nachteil dieser Änderungen war, dass sie deutlich die Effizienz der Methode bzw. oft nicht physiologischen Bedingungen während der Elution Schritt, gefährden die Integrität oder die Aktivität der gereinigten Proteine reduzieren.
Hier beschreiben wir einen anderen Ansatz zur Lösung des inhärenten Problems der Biotin/Streptavidin-Strategie mittels RNA Substrate, in denen Biotin ist kovalent an das 5′ Ende über eine Foto-spaltbaren 1-(2-Nitrophenyl) Ethyl-Verbindungsgruppe, die empfindlich gegen UV13,14lange Welle. Wir testeten diese Vorgehensweise für die Reinigung der begrenzende U7-abhängige Verarbeitungsmaschinen von Drosophila und Säugetieren nuklearen extrahiert15. Nach einer kurzen Inkubation von Histon Pre-mRNA enthalten Biotin und der Foto-spaltbaren Linker mit einem nuklearen Extrakt die versammelten Verarbeitung komplexe auf Streptavidin Perlen immobilisiert, gründlich gewaschen und sanft in eine Native Lösung veröffentlicht Form durch die Einwirkung von ~ 360 nm UV-Licht. Die UV-Elution Methode ist sehr effizient, schnell und unkompliziert, mit ausreichenden Mengen an der U7-SnRNP, seine Komponenten durch Splitter von weniger als 100 µL der Extrakt15Färbung zu visualisieren. Das UV-eluiert Material ist frei von Hintergrund-Proteine und für direkte Massenspektrometrie Analyse, zusätzliche Reinigungsschritte und enzymatische Assays geeignet. Die gleiche Methode kann zur Reinigung von anderen RNA/Proteinkomplexe angenommen werden, die relativ kurze RNA-Bindungsstellen erfordern. Biotin und der Foto-spaltbaren Linker können auch kovalent, Einzel – und doppelsträngige DNA, potenziell Verlängerung der UV-Elution Methode zur Reinigung von verschiedenen DNA/Protein-komplexe befestigt werden.
Chemische Synthese von RNA-Substrate mit kovalent angebracht Biotin und der Foto-spaltbaren Linker ist praktisch nur mit den Sequenzen, die nicht mehr als ~ 65 Nukleotide, teuer und ineffizient für deutlich längere Sequenzen. Um dieses Problem zu beheben, entwickelten wir auch einen alternativen Ansatz, der für viel länger RNA-bindende Ziele geeignet ist. Bei diesem Ansatz RNA von beliebiger Länge und Nukleotid-Reihenfolge ist generierten in Vitro durch T7 oder SP6 Transkription und geglüht, eine kurze ergänzende Oligonukleotid enthält Biotin und der Foto-spaltbaren Linker am 5′-Ende (trans (Konfiguration). Resultierende Duplex wird anschließend verwendet, um einzelne bindende Proteine oder makromolekulare komplexe auf Streptavidin-Perlen, die nach dem gleichen Protokoll beschrieben für die RNA-Substrate mit Foto-spaltbaren Biotin kovalent verbunden zu reinigen (GUS Konfiguration). Mit dieser Änderung kann die Foto-spaltbaren Biotin in Verbindung mit in Vitro generierten Protokolle mit Hunderten von Nukleotiden, Erweiterung der UV-Elution Methode zur Reinigung von einer breiten Palette RNS/Protein verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode ist unkompliziert und neben der Einbeziehung eines Foto-spaltbaren Linkers und der UV-Elution Schritt unterscheidet sich nicht von den gängigen Methoden, die die extrem starke Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin nutzen. Der UV-Elution Schritt ist sehr effizient, in der Regel die Freigabe mehr als 75 % der immobilisierten RNA und Proteine aus Streptavidin Perlen, hinterlässt einen hohen Hintergrund von Proteinen, die unspezifisch an die Perlen zu binden verbunden. Durch den Wegf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken unseren Kollegen und Mitarbeitern für ihren Beitrag zu unserer Arbeit. Diese Studie wurde unterstützt durch das NIH GM 29832 zu gewähren.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
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