-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

In eukaryoten ondergaan RNA polymerase II gegenereerde mRNA precursoren (pre-mRNAs) verschillende evenementen van de rijping in de kern voordat hij volledig functionele mRNA sjablonen voor de eiwitsynthese in het cytoplasma. Een van deze gebeurtenissen is 3′ eind verwerking. Voor de overgrote meerderheid van de pre-mRNAs omvat 3′ eind verwerking decollete gekoppeld aan polyadenylatie. Deze twee stappen-reactie wordt gekatalyseerd door een relatief overvloedige complex bestaande uit meer dan 15 eiwitten¹. Dierlijke replicatie-afhankelijke Histon pre-mRNAs worden verwerkt aan de 3′-eind door een ander mechanisme waarin de hoofdrol wordt gespeeld door U7 snRNP, een lage overvloed complex bestaande uit snRNA van de U7 van ~ 60 nucleotiden en meerdere eiwitten^2,3 . De U7 snRNA baseparen met een specifieke opeenvolging Histon pre-mRNA en één van de subeenheden van de U7 snRNP katalyseert de splitsingsproducten-reactie, het genereren van volwassen Histon mRNA zonder een poly(A) staart. 3′ eind verwerking van Histon pre-mRNA vereist ook stam-Loop bindende eiwit (SLBP), die een geconserveerde stam-lus ligt bindt stroomopwaarts van de breukzijde en verbetert de aanwerving van de U7 snRNP naar de substraat^2,3. Studies die gericht zijn op het identificeren van de afzonderlijke onderdelen van de U7 snRNP geweest uitdagend vanwege de lage concentratie van de U7 snRNP in dierlijke cellen en de tendens van het complex te distantiëren of gedeeltelijke proteolyse ondergaan tijdens het zuiveringsproces ongehinderd door het gebruik van milde detergentia^4,5,6, hoge zout wast en/of meerdere chromatografische stappen^7,–^8,9.

Onlangs, om te bepalen van de samenstelling van de machines voor het behandelen van de U7-afhankelijke, was een kort fragment van Histon pre-mRNA met biotine op 3′ of 5′ geïncubeerd met een nucleaire extract en de geassembleerde complexen werden vastgelegd op daar beklede agarose kralen^5,6,10. Als gevolg van de uitzonderlijk sterke interactie tussen Biotine en daar, waren de eiwitten geïmmobiliseerd op daar kralen geëlueerd onder de voorwaarden door te koken in SDS denaturering en geanalyseerd door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Terwijl deze eenvoudige aanpak een aantal onderdelen van de U7 snRNP vastgesteld, leverde het relatief ruwe monsters, vaak besmet met een groot aantal achtergrond eiwitten nonspecifically gebonden aan daar kralen, sommige onderdelen van potentieel te maskeren de machines voor het behandelen en voorkomen van hun detectie op zilver gekleurde gels^5,6,10. Nog belangrijker is, deze aanpak ook uitgesloten geen functionele studies met de geïsoleerde materiaal en haar verdere zuivering aan homogeniteit door aanvullende methoden.

Een aantal wijzigingen werden voorgesteld na verloop van tijd inspelen op het vrijwel onomkeerbare karakter van de interactie van biotine/daar, met de meeste van hen wordt ontworpen ofwel verzwakken de interactie of een chemisch cleavable spacer arm in de Biotine-bevattende reagentia^11,12. Het nadeel van alle wijzigingen van deze was dat ze aanzienlijk de doeltreffendheid van de methode en/of vaak vereist niet-fysiologische omstandigheden tijdens de elutie stap verminderen, de integriteit of de activiteit van de gezuiverde eiwitten in gevaar te brengen.

Hier beschrijven we een andere aanpak om de inherente probleem te verhelpen van de strategie van biotine/streptavidine met behulp van RNA substraten waarin Biotine covalent is bevestigd aan de 5′ einde via een foto-cleavable 1-(2-nitrofenyl) ethyl-groep die is gevoelig voor de lange golf UV^13,14. Wij testten deze aanpak voor de zuivering van de beperkende machines voor het behandelen van U7-afhankelijke van Drosophila en zoogdieren nucleaire extracten¹⁵. Na een korte broedtijd van Histon pre-mRNA met biotine en de foto-cleavable linker met een nucleaire extract, de geassembleerde verwerking complexen zijn geïmmobiliseerd op daar kralen, grondig gewassen en voorzichtig vrijgegeven aan oplossing in een native formulier door blootstelling aan ~ 360 nm UV licht. De UV-elutie-methode is zeer efficiënt, snel en eenvoudig, voldoende hoeveelheden van de U7 snRNP te visualiseren van de componenten ervan door Splinter kleuring van zo weinig zoals 100 µL van het extract¹⁵oplevert. Het materiaal UV-geëlueerd is gratis achtergrond eiwitten en geschikt voor directe massaspectrometrie analyse, extra zuivering stappen en enzymatische tests. Dezelfde methode kan worden vastgesteld voor de zuivering van andere RNA/eiwitcomplexen, die relatief korte RNA bandplaatsen vereisen. Biotine en de foto-cleavable linker kunnen ook worden covalent bevestigd aan één – en dubbelstrengig DNA, de UV-elutie-methode voor de zuivering van diverse complexen van de DNA/proteïne potentieel uit te breiden.

Chemische synthese van RNA substraten met covalent gekoppeld Biotine en de foto-cleavable linker is praktisch alleen met de sequenties die overschrijd niet ~ 65 nucleotiden, steeds dure en inefficiënte voor aanzienlijk langere sequenties. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelden we ook een alternatieve benadering die geschikt is voor veel langer RNA-bindende doelstellingen. In deze benadering RNA van elke lengte en nucleotide sequentie is gegenereerd in vitro van de Transcriptie T7 of SP6 en gegloeid om een korte aanvullende oligonucleotide dat bevat Biotine en de foto-cleavable linker eind 5′ (trans configuratie). De resulterende duplex wordt vervolgens gebruikt voor het zuiveren van individuele bindende proteïnen of macromoleculaire complexen op daar kralen na hetzelfde protocol beschreven voor de RNA-substraten met foto-cleavable Biotine covalent aangesloten (cis configuratie). Met deze wijziging, kan de foto-cleavable Biotine worden gebruikt in combinatie met in vitro gegenereerd afschriften met honderden nucleotiden, uitbreiding van de UV-elutie-methode voor de zuivering van een brede waaier van RNA/proteïne.