Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador

Em eucariontes, precursores do RNA polimerase II-gerado mRNA (pre-mRNAs) submeter-se a vários eventos de maturação no núcleo antes de se tornar totalmente funcional modelos de mRNA para síntese de proteínas no citoplasma. Um desses eventos é o processamento de final 3′. Para a grande maioria dos pre-mRNAs, processamento de final 3′ envolve a clivagem acoplada a poliadenilação. Esta reação em duas fases é catalisada por um complexo relativamente abundante constituído por mais de 15 proteínas¹. Animais de replicação dependente de histona pre-mRNAs são processados na extremidade 3′ por um mecanismo diferente em que o papel principal é interpretado por U7 snRNP, uma baixa abundância complexa consistindo de snRNA U7 de ~ 60 nucleotídeos e várias proteínas^2,3 . Os pares de bases de snRNA U7 com uma sequência específica na histona pre-mRNA e uma das subunidades da snRNP U7 catalisa a reação de clivagem, gerando histona madura mRNA sem um poli da cauda. 3′ processamento de final de histona pre-mRNA também requer hairpin Loop ligação proteína (SLBP), que vincula um conservado Hairpin loop localizado a montante do local clivagem e melhora o recrutamento da snRNP U7 ao substrato^2,3. Estudos que visam identificar os componentes individuais da snRNP U7 tem sido desafiadoras devido a baixa concentração do U7 snRNP em células animais e a tendência do complexo para dissociar ou sofrer proteólise parcial durante a purificação devido à utilização de detergentes suaves^4,5,6, lavagens de sal elevadas e/ou múltiplas etapas cromatográficas^7,8,9.

Recentemente, para determinar a composição das máquinas processamento U7-dependente, um pequeno fragmento de biotina contendo de histona pre-mRNA em 3′ ou 5′ foi incubado com um extrato nuclear e os complexos montados foram capturados na streptavidin-revestido agarose grânulos^5,6,10. Devido a excepcionalmente forte interação entre biotina e estreptavidina, proteínas imobilizadas em grânulos streptavidin foram eluídas sob condições de desnaturação por ebulição em SDS e analisadas por coloração de prata e espectrometria de massa. Enquanto essa abordagem simples identificou uma série de componentes da snRNP U7, isso rendeu amostras relativamente brutas, muitas vezes contaminadas com um grande número de proteínas de fundo nonspecifically acoplado a grânulos de estreptavidina, potencialmente, mascarando alguns componentes do as máquinas de processamento e impedindo a sua detecção a prata manchada géis^5,6,10. Importante, esta abordagem também impedida qualquer estudos funcionais com o material isolado e sua depuração adicional a homogeneidade por métodos adicionais.

Foram propostas várias modificações ao longo do tempo para abordar a natureza praticamente irreversível da biotina/estreptavidina interação, com a maioria deles sendo projetado ou enfraquecer a interação ou para fornecer um braço quimicamente cleavable espaçador na Biotina-contendo reagentes^11,12. O lado negativo de todas essas modificações foi que eles reduzem significativamente a eficiência do método e/ou condições não-fisiológicas, muitas vezes exigidas durante a etapa de eluição, pondo em risco a integridade ou a atividade das proteínas purificadas.

Aqui, descrevemos uma abordagem diferente para resolver o problema inerente da biotina/estreptavidina estratégia usando o RNA de substratos em que biotina está covalentemente ligada à 5′ acabam através de uma foto-cleavable 1-(2-nitrofenil) moiety etílico que é sensível a onda longa UV^13,14. Nós testamos esta abordagem para a purificação do mecanismo de processamento do limitante U7-dependente da drosófila e mamíferos nuclear extrai¹⁵. Após uma incubação curta de biotina contendo de histona pre-mRNA e o vinculador foto-cleavable com um extrato nuclear, os complexos de processamento montados são imobilizados em grânulos streptavidin, cuidadosamente lavados e lançados suavemente a solução em um nativo formulário pela exposição à luz de ~ 360 nm UV. O método de eluição de UV é muito eficiente, rápido e simples, produzindo quantidades suficientes da snRNP U7 Visualizar seus componentes por tira mancha de tão pouco como 100 µ l de extracto de¹⁵. O material UV-eluída é livre de proteínas de fundo e adequados para análise de espectrometria de massa direta, as etapas de purificação adicional e ensaios enzimáticos. O mesmo método pode ser adoptado para a purificação de outros complexos de RNA/proteína que exigem relativamente curtos locais obrigatórios de RNA. Biotina e o foto-cleavable vinculador também podem ser ligado covalentemente ligados para single – e ADN double-stranded, potencialmente estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de vários complexos de DNA/proteínas.

Síntese química de substratos de RNA contendo covalentemente ligados a biotina e o vinculador foto-cleavable é prático apenas com as sequências que não excedam ~ 65 nucleotídeos, tornando-se caro e ineficiente para sequências significativamente mais tempo. Para resolver este problema, desenvolvemos também uma abordagem alternativa que é adequada para alvos de ligação de RNA muito mais tempo. Nesta abordagem, RNA de qualquer sequência de comprimento e o nucleotídeo é gerado em vitro pela transcrição T7 ou SP6 e recozido para um curtas do oligonucleotide complementar que contém biotina e o foto-cleavable vinculador na extremidade 5′ (trans configuração). O duplex resultante é posteriormente usado para purificar proteínas individuais ou complexos macromoleculares em grânulos streptavidin seguindo o mesmo protocolo descrito para os substratos de RNA contendo biotina foto-cleavable ligada covalentemente (cis configuração). Com essa modificação, a foto-cleavable biotina pode ser usada em conjunto com transcrições em vitro gerado contendo centenas de nucleotídeos, estendendo-se o método de eluição de UV para a purificação de uma ampla gama de RNA/proteína.