新生児モデル敗血症マウスの制御モデル

このプロトコルのすべての実験は、プロトコル番号 A17-0110 の下で動物の世話をブリティッシュ ・ コロンビアの大学委員会によって承認されています。 1. ツール殺菌 生物学的安全キャビネット (BSC) をオンにし、予熱 250 ° C、使用する前に、少なくとも 30 分に熱いビーズ滅菌。 70% エタノールでツールを浸しなさい。 1 分の最低予熱した熱いビーズ滅菌にツールが水没します。注: ツールのハンドルは熱くなるし、1.5 分以上のホット ビーズ滅菌の場合に燃やすことができます。 それを殺菌し、70% エタノールとペーパー タオルのマットをスプレーします。 滅菌水中の他のツールの非滅菌処理するツール部に触れることがなくホット ビーズ滅菌器からツールを削除して、エタノール スプレー ペーパー タオルの上に置きます。 30 を待つ s 郭清のためにそれらを使用する前に冷却するためのツールを 2 分します。 2. 盲腸スラリーの調製 15 mL 遠沈管 (安楽死するすべての 5 のマウスの 1 つの管) を preweigh します。 ローカル動物のケアのガイドラインに従って盲腸スラリー ドナーを安楽死させるか以下のプロトコルを使用します。注: 6 および 12 週の間の 40 の c57bl/6 j マウスまで古いと使用された盲腸スラリー調製のため最大 5 匹同時に安楽死します。 安楽死室へマウスを移動し、イソフルラン麻酔器を酸素血流を 5% に設定します。 マウス移動して麻酔の手術の平面に入るそれらを参照する能力の損失を観察し、最後に、呼吸を停止を監視します。 安楽死室から、マウスを削除、その足を挟まない、脚引き込みまたは吸入を観察します。いずれかが存在する場合は、安楽死室; マウスを返すそうでなければ、続けます。 急激な頚部転位によってマウスを安楽死末期。 盲腸の郭清、BSC の presterilized と冷却ツール (セクション 1 を参照してください) を使用を実行します。 マウスその腹部には 23 G 針を使用して押し出し発泡ポリスチレン ボードをマウスの足を固定します。確保し、70% エタノールで腹部をスプレーします。 滅菌ピンセットとはさみを使って、皮膚を切って、右側にはさみ、カット オープン、胸骨に脚の付け根から四角形領域と腹膜のライニングと左側から皮膚を緩めます。腹膜から任意の毛皮を削除します。 切り替えツールものがコンタクトを使用されている場合、皮膚肌のため行われていた長方形の開口部を作り、腹膜を断ち切る滅菌道具の新しいペアに切り替えます。 ボディに右に走る左が盲腸を識別します。腸から盲腸の枝を識別し、腸から盲腸をカットする結合組織を混乱させます。紙の重さの滅菌シートで盲腸の場所。注: は、どちらかの側面との両方でそれを残して、乾燥する 70% エタノール噴霧や紫外線照射による滅菌することが紙の重量を量るします。また、盲腸は滅菌ペトリ プレートで解剖できます。 盲腸コンテンツ押出 BSC、無菌のツールを使用して、盲腸の両端をカットします。 滅菌ピンセットで盲腸の中央を押し、盲腸内容カットを終了すると、転がり運動と上皮を引き裂くことができるスクレーピング動きを回避するを使用して優しくプッシュするフラット滅菌金属ヘラを使用します。内容を収集し、preweighed 15 mL 遠心管にそれらを置きます。 同じチューブから最大 5 つのマウスの盲腸内容にプールします。チューブの重量を量るすべての内容が追加されると再び。注: 期待する 300 mg の平均と最大 390 mg あたりマウス盲腸スラリー、マウスごと再懸濁の D5W の 2.4 1.8 mL を必要とします。このステップの間に 5 つ以上のマウスを使用してしたがって、15 mL 遠心管を満杯に。 エタノール スプレー ペーパー タオルときれいなツールをワイプし、手順 1.2 1.6 を繰り返すことによってそれらを滅菌します。 盲腸のスラリーのろ過 盲腸内容でいっぱい遠心管の重量を量るし、盲腸内容の重量を割って次式のように、1 ミリリットル当たりミリグラムの望ましい株式集中して盲腸内容に追加する D5W の量を計算します。 BSC の盲腸内容を含む 15 mL 遠心管に冷たい D5W の必要な量を追加します。 渦 15 mL 遠心分離機管の垂直方向と水平方向に、直径 1-3 mm 以上の粒子の 30 s. チェックのと場合は、引き続きボルテックスまですべての大きな粒子が目に見えて消えています。 氷上に置いた 50 mL の遠心管に滅菌 70 μ m の細胞のストレーナーを配置します。セル ストレーナーにし、コレクションの管に盲腸の再懸濁液の 4 mL のピペットします。X-3 2x 上下ピペッティングにより粒子を再懸濁します。フィルタ リングされてないより多くの水滴がなくなるまでピペット チップで内容を攪拌しながらフィルタ リングの速度を増加する気泡を押し出す優しく。注: 混合使用する場合可能性があります微粒子 5 mL ピペットを接続するのに十分な大きさ。この場合、ステップ、2.5.3 からボルテックスを繰り返し、ソリューションまだ壊れない離れて場合、は、遠心分離機管の壁に粒子を押すピペットを使用します。 手順を繰り返します 2.5.4、セル ストレーナー盲腸スラリーの各チューブとプールの間の変更のすべての内容、氷で保たれる同じ 50 mL 遠心分離機コレクションの管にまたは 2 番目の 50 mL の遠心管に濾液量がアイス ボックスに氷レベルを超えた場合。 盲腸のスラリーの約数。 該当する場合より大きい滅菌容器 (例えば、1,000 mL ストレージ ボトル) ステップイン 2.5.5 から複数 50 mL 盲腸スラリー濾液チューブを組み合わせます。その後、15 s と場所新しい 50 mL の遠心管に 20 mL の渦。 渦は 5-10 秒の時間をかけて蒸発を防ぐために、ゴムのシールがある 3 つの 2 mL セラム チューブに 500 μ L 分注 50 mL の遠心管に盲腸スラリー株式。すぐに氷の上マスター ストックと検体のセラムを配置します。 2.6.1 と 2.6.2 手順を繰り返してと、検体、盲腸のスラリーのすべてされているボルテックス任意の粒子の沈降を防止し、均一混合物を維持するためにすべての 3 つセラム チューブ後マスターの在庫。 -80 ° C で盲腸スラリー試料を凍結します。注: は、各大人のマウスから 500 μ L で 3 〜 4 在庫バイアル間期待します。各株式のバイアルは、DOL 7 で 8 匹の挑戦の 1 つのくずにほぼ十分なはずです。 3. 敗血症 7 日齢の新生仔マウスの挑戦 分離、識別、および新生仔マウスの重量を量る。 BSC、ダムからマウスを保持し、ダムにストレスを減らす新しいケージに新生仔マウスを転送します。 削除し、手袋にケージのにおいを転送する手袋とネストの材料の一部をこする。小さい巣にネスティング材料を成形し、ダムなしの新しいケージに入れます。 新生仔マウスを新しいケージにネスト材料に転送します。 新しいケージに 2 番目の空の巣を作るより多くのネスト材料を転送します。 終了して、新生仔マウスの苦痛のいずれかを聞くことからダムに負荷がかかっていないので、フードからダムのケージを削除します。 時間をかけてゴミの内で個々 の新生児マウスを追跡するためには、前面または必要に応じてすべての 12-24 時間を再適用する尾の逆に 1 ~ 5 個のドットをマークするのにエタノール証拠マーカーを使用します。 挑戦は、計量後巣セカンダリにそれぞれ配置してすべてのマウスのこの手順を繰り返します各マウスの重量を量る。 ダムに割り切れる盲腸スラリーの挑戦を準備する前に全体のごみを返します。 個別に各くずに対してこの手順を完了する、以下の計算または指定されたワークシートを使って盲腸スラリー及び必要な希釈 D5W の個々 の重量調整用量を計算する (補足ファイルを参照してください)。 盲腸スラリー マウス (c) のグラム当たりのミリグラムで必要なチャレンジ線量グラム (b) でマウスの重量を掛けることによってそれぞれのマウスに投与すること (、) 盲腸スラリーのミリグラムを計算します。 ストックの盲腸スラリー濃度、盲腸のスラリーの 160 mg ステップ 3.2.1 (、) からのマウスごとに必要な盲腸のスラリーのミリグラムを割ってマイクロリットル (d) のマウスごとに必要な原液の盲腸スラリー株式の個々 のボリュームを計算します。D5W の 1 ミリリットルあたり (e) マイクロリットル ミリリットルから変換する 1 ミリリットルあたり 1,000 μ L を乗算することです。 盲腸のスラリーの在庫数量がnマウス、マウス (n) の数で割った値のごみのマウスあたり盲腸スラリー株式 (d) の量を合計することによってマウス (g) あたり必要な平均。 マウス (g) あたりに必要な盲腸のスラリーの平均在庫量平均注入量 (100 μ L) で割って盲腸スラリー株式 (h) 平均希釈倍率を計算します。 平均希釈倍率 (h) 在庫盲腸スラリー必要 (d) の各マウスのボリュームを乗じてマイクロリットル (j) でそれぞれのマウスの特定の注入量を計算し、最も近い 10 にそれを丸く (一致するように、10 μ L ずつ注射器)。 平均注入量 (100 μ L) から平均盲腸スラリー株式 (g) を引いて D5W 盲腸スラリー株式 (k) を希釈するための平均必要量を計算します。 このゴミ (n) でマウスの数によってマイクロリットル (g) でマウスあたり平均株価盲腸スラリーを乗算し、余分なを作成する 1.4 を掛けることにより盲腸スラリー入荷マイクロリットル (l) の合計金額を計算します。 マイクロリットル (m) D5W の平均必要量を乗じて盲腸スラリー株式をうすめる必要で D5W の合計金額を算出 (k) マウス (n) および余分な作成に 1.4 を掛ける数。 ストック盲腸スラリー必要 (ステップ 3.2.7 からl ) の量を計算した後の挑戦因数を準備します。BSC、必要な室温、ピペッティングをミックスするその内容で盲腸スラリー株式バイアル数を解凍します。 これ以上目に見える氷の結晶解凍盲腸スラリー内に存在場合は、滅菌 1.8 mL 遠心チューブに盲腸スラリー株式 (ステップ 3.2.7 からl ) の計算量を転送します。 3.2.8 (m) の手順で計算された冷たい D5W を追加することで必要な濃度に希釈します。氷上チャレンジ因数を格納します。 注射器をロードする前に、それをフリックで遠心チューブをミックスの策定と盲腸スラリーの 300-500 μ L を追放して 500 cc 28 G 1/2 インチ インスリン注射器で 3 x を続けて、20 x。 同じ注射器に盲腸スラリーの約 150 μ L を描画します。 プランジャーから気泡を除去し、注射器で少し引く、泡を追放し、シリンジにフリックします。 3.2.5 (j) の手順で個々 のマウスが注射器に読み込まれるために計算された、1 つのマウスの盲腸のスラリーの適切な量まで遠心チューブに戻って余分な盲腸スラリーを調剤します。 腹腔内関連ローカル動物医療機関のガイドラインによると盲腸のスラリーを注入または以下の手順を使用します。 BSC 手順 3.1 ダムから新生児マウスを区切ります。 首筋、首の後ろでマウスは親指および人差し指を使用して。 背中の中間およびリング指、またはリングとピンキーの指の前にねずみのしっぽを保護します。 、リークを最小限に抑える傾け新生児マウスを使用して、それは下向き、上向き、足と性器、浅いと皮下に針を維持する間針の針ベベルを挿入します。 1 cm の針を挿入すると、下方に押し、腹膜を穿刺針を感じる転送します。ゆっくりと横方向の動きは、マウスの臓器を傷つけることが、針の先端を可能な限りとして着実に維持する、ピストンを低下させます。 慎重に針を撤回 5-10 秒、マウスのボディの緊張を減らすために除去の中に中指をリラックスのように、同じルートに続きます。 漏れをチェックするには、時間を閉じるには、注射部位に針を除去した後数秒間マウスを押したまま、任意の漏れまたはその時点でマウス使用しないでください分析の注射部位の膨隆を観察します。注: 注射部位の皮膚の隆起が皮下注射液で失敗した腹腔内投与を示します。 ペーパー タオルの上にマウスを置くし、一歩を踏み出すには、マウスを許可します。マウスが携帯電話 5 の場合 s、尾を軽く押します。 マウスをピックアップし、注射部位の盲腸のスラリーの漏れをチェックします。漏れがある場合、マウスを解析から除外してマウスを安楽死させます。 4. マウスの監視 人道的エンドポイントに到達するためにそれらをチェックする定期的にマウスを監視します。 2 h postchallenge 注入関連合併症のマウスを観察します。 敗血症関連の罹患率および人道的エンドポイントでマウスの id にマウス 12 h postchallenge を監視 (手順の基準 4.2 4.3 を参照)。 その後最初の 2 日間、一晩、8 h を除く新生児マウスが出席したすべての 4 〜 6 時間を監視します。 2 日 postchallenge を超えて一日 1 x-2 x を監視します。病気マウスまたはマウスの正常性スコアの減少が観察される場合は、すべての 4 〜 6 時間に監視の頻度を増やします。 新生仔マウスを監視 新生仔マウスを含む任意のプロシージャの転送新しいケージに素材の寝具 3.1 の手順で説明するよう (同じ理由で説明したようにある)。看護しながら巣からドラッグされた新生児を慎重に確認します。マウスに散在する、看護しながらトイレからドラッグするマウスはありません。 上部を取り外す、巣は新生仔マウスの任意の散乱を巣からいずれかで識別またはネスト材料、看護しながらトイレからドラッグ マウスを除いて、彼らの同腹子から立ち往生。4.5 の手順で基準マウスが見つかった場合散乱人道的エンドポイントを参照してください。 マウスの立ち直り反射と移動度を測定します。 ペーパー タオルの上にマウスを配置し、最大 4 内自体を右に、その能力の監視 s。その背中に置かれたとき、マウスがオブジェクトの左側または右側には、4 s のカウント開始に分類されます。注:「権利」グループに分類されるマウスする必要があります少なくとも取得することができる 1 のペーパー タオルの上のパッドの足 3 つ 4 つの s です。それはまだそれが倒れる場合自体を右することとしてグループ化されます。 8 の場合は、マウス自体を右することができます、待ちます s モビリティのレベルを判断します。 自体を右行に複数の手順を実行して、環境を探検することができる場合は、マウス「権利-モバイル」として分類します。 自体を右、その環境を探索するいくつかの手順を実行することができます「権利無気力」としてマウスを分類します。このグループのマウスがステップしながら倒れ、自分の足で不安定に見るし、ステップ間で一時停止します。 それは自体を右することができますが、多くの周りに移動しません「権利 Nonmobile」としてマウスを分類します。それはまだ、落ちることがありますそれは 8 内のステップを行われない場合、s、権利 Nonmobile としてグループ化されます。 マウス可能性があります自体適切でない、観測された股関節の動きに基づいて移動性を分類します。注: を繰り返さない監視またはスコアリング システムと人道的エンドポイントに影響を与えることができるので、マウスが背中に費やしている時間の長さを増加して、時々 4 s 内自体を右に失敗するマウスとしてそうすればより多くの時間を与えられました。 分類としてマウス「右 (FTR) に失敗する-モバイル」それ自体を右ことができない水平から 90 ° の角度を超えると股関節の動きが表示されるかどうか。一部のマウスで右自身 4 以上を指定した場合 s が、まだ腰の動きに基づいて移動スコアと FTR、として分類される必要があります。 それは自体を右することができる、水平方向から 90 ° の角度の下の腰の動きが表示される場合は、「FTR 無気力」としてマウスを分類します。 「FTR-Nonmobile」それは自体を右することができる、足を振るまたは振動を持っている場合がない腰の動きとマウスを分類します。手足が拡張または撤回はない横方向の動きがあります。マウスは、目に見えて病気人道的エンドポイントに達した。 双方を記録、マウス側 4.3 手順を繰り返します。注: は、観測を記録するための補足ファイルを参照してください。 マウス人道的エンドポイントでは、安楽死、以下に表 1のとおりを必要とするかどうかを決定します。 マウスを異なる立ち直りと 4.3 と 4.4 の手順に記載されている監視観測に基づく移動レベルに分類しました。マウスの移動は、各側の測定し、モバイルの動作がマウスに安楽死が必要かどうかを決定する使用されます。 人道的エンドポイントに巣から分離 FTR-Nonmobile (a) または (b) FTR 無気力の反射と、真っ直ぐにすることではネズミを割り当てます。 20 h postchallenge を超える時間ポイントを監視、表示されているデータは、これらのマウスは最終的に病気に屈するし、そうでない高精度で予測するため任意マウスの「右に失敗」人道的エンドポイントで両側の立ち直り反射とを分類します。回復します。 4.5 の手順で決定された安楽死させたことに、別のマウス。人道的エンドポイントでは、監視対象のマウスが表示されない場合、ダムなし新しいケージに 2 番目の空の巣に配置し、他の新生児マウスに進みます。 全体のごみを監視すると、新生仔マウスの中央の部屋に巣を改質、ダムでケージにネスト材料の半分を移動します。注: 不適切な形式の巣に散布し、ダムを提供することができます利用可能なケアの量を減らすにマウス可能性があります。 ダムとケージに戻って新生児マウスを転送します。 くずに残りのネスト材料を置くと場所のネスト材料を保護する蓋の周りそれをつまんで優しく巣くずを囲みます。 地方機関の要件に従ってステップ 4.6 で区切られた新生児マウスを安楽死させます。 5. 盲腸のスラリーの滴定 必要な課題の線量 (セクション 3) でマウスに挑戦し、成果 (セクション 4) を監視します。 最終的な結果が必要な LD の結果かどうかを観察し、そうでない場合によって 5%-10% を調整して上位または下位の挑戦用量で新しいごみのセクション 3 と 4 を繰り返します。注: チャレンジ用量に図 1 bのようかもしれない各施設とマウスのひずみの価する必要があります。 また、マウスが高速または図 1 bで期待される速度よりも遅い人道的エンドポイントを達成してセクション 3 と 4 で 5%-10% を調整して上位または下位の挑戦用量で新しいごみを繰り返すかどうかを確認します。