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Immunology and Infection

Eine kontrollierte Mausmodell für neonatale Sepsis Biofilm

Published: January 27, 2019
doi:
10.3791/58574
, , , , , , , , ,
1Department of Experimental Medicine,University of British Columbia, 2Department of Pediatrics, Division of Infectious Diseases,University of British Columbia, 3Department of Pediatrics, College of Medicine,University of Florida, 4Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine,University of Florida

Summary

Dieses Protokoll bietet die notwendigen Schritte zu etablieren und neonatale Sepsis bei 7 Tage alten Mäusen zu bewerten.

Abstract

Neonatale Sepsis bleibt eine globale Belastung. Präklinischen Modell Bildschirm wirksamen prophylaktischen oder therapeutischen Interventionen ist erforderlich. Neugeborenen Maus Biofilm Sepsis kann ausgelöst werden durch intraperitoneale Injektion von cecal Gülle in Tag des Lebens 7 Mäuse und Überwachung für die folgende Woche. Hier sind die einzelnen Schritte für die Umsetzung dieses Modells neonatale Sepsis erforderlich. Dazu gehört, so dass eine homogene cecal Gülle Lager, verdünnen es auf eine Portion Gewicht und Wurf eingestellt, einen Überblick über die Überwachungszeitplan und eine Definition der beobachteten Gesundheit Kategorien verwendet, um humane Endpoints definieren. Die Generierung einer homogenen cecal Gülle-Aktie von gepoolten Spendern ermöglicht die Verwaltung in viele Würfe im Laufe der Zeit reduzieren die Variation zwischen den Gebern und verhindern, dass potenziell toxischen Glycerin. Die Überwachungsstrategie verwendet ermöglicht die Antizipation des Überlebens Ergebnis und die Identifizierung von Mäusen, die später zum Tode, zulassend eine frühere Identifizierung des humanen Endpunkts Fortschritte machen würde. Zwei Hauptmerkmale Verhaltensstörungen werden verwendet, um Integritätsbewertungen, nämlich die Fähigkeit des neugeborenen Mäusen, selbst auf dem Rücken und dem Grad ihrer Mobilität richtig zu definieren. Diese Kriterien könnten potenziell auf Adresse humane Endpoints in anderen Studien mit Neugeborenen Krankheit bei Mäusen, angewandt werden, solange eine Pilotstudie durchgeführt, um die Genauigkeit zu bestätigen. Zusammenfassend stellt dieser Ansatz eine standardisierte Methode, um Modell Neugeborenen Sepsis bei Mäusen, während der Bereitstellung von Ressourcen zur Bewertung des Tierschutzes verwendet, um frühe humane Endpunkte für Behinderte Tiere zu definieren.

Introduction

Sepsis ist eine führende Ursache des menschlichen Neugeborenen ansteckende Todesfälle1. Weil Neugeborenes Sepsis schlecht verstanden wird, wurden in die Identifikation von gefährdeten Neugeborenen früh während der Krankheit und die Entwicklung von wirksamen Behandlungen oder Prophylaxen wenig Fortschritte erzielt. Dies erfordert den Einsatz von Tiermodellen der Sepsis, die Prozess und möglichen Interventionen besser zu verstehen. Des weiteren reagieren Erwachsenen Nagetiere unterschiedlich auf Sepsis mit statistisch signifikante Unterschiede in der Zahl der Bakterien zu verwalten, um die gleichen letale Dosis (LD) zu erhalten und die Unterschiede in der daraus resultierenden Wirtsantwort verglichen mit Neugeborenen2. So hat neonatale Sepsis beim Neugeborenen untersucht werden. Mehrere Erwachsene Sepsis-Modelle wurden in der Sepsis-Forschung verwendet. Dazu gehören eine intravenöse Herausforderung mit bestimmten Organismen, die bei erwachsenen Menschen Sepsis oder cecal Ligatur und Punktion (CLP) in Verbindung gebracht. CLP ist eine endogene Herausforderung Modell wo der Blinddarm ist chirurgisch isoliert ligiert und punktiert um Austritt von Darminhalt in das Peritoneum zu ermöglichen, führt schließlich zu einer systemischen Verbreitung der Mikroben und ihre Produkte3. Der chirurgische Eingriff herstellen CLP erforderlich ist jedoch tödlich für neugeborene Tiere; Daher muss eine alternative Methode die Biofilm Herausforderung CLP induzieren neonatale Sepsis zu imitieren. Das cecal Gülle-Modell für neonatale Biofilm Sepsis wurde entwickelt, um diesem Bedarf zu begegnen, wobei die cecal Inhalte von Tieren geerntet, in sterilen Dextrose 5 % in Wasser (D5W) ausgesetzt und intraperitoneal injizierten Neugeborene Mäuse2. Dies, da geworden ein zunehmend beliebtes Modell Sepsis bei Neugeborenen und erwachsenen Tieren zu studieren und hat erheblich erweiterte mechanistische Einblicke in die Krankheit Prozess4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.

Angesichts der zunehmenden Nutzung dieses Modells und der Forscher wollen Ergebnisse direkt über Publikationen zu vergleichen, gibt es eine Notwendigkeit für die technischen Aspekte gut beschrieben und standardisierte über Studien zu sein. Standardisierung bezieht sich auf drei Aspekte des Modells, nämlich i) die Vorbereitung der cecal Gülle bestand, (Ii) die Vorbereitung der Herausforderung Aliquote für die Injektion in den Versuchstieren und (Iii) die Definition des humanen Endpunkts wobei Tiere Nonsurvivors im Challenge-Experimente gelten. Insbesondere werden Methoden zur Vorbereitung des cecal Gülle bestand oft auf den ursprünglichen Artikel Einführung in das Modell2verwiesen. Eine kurze Zusammenfassung dieses Modells ist, dass cecal Inhalt von Erwachsenen Mäusen wurden geerntet, in sterilen D5W zu einer Konzentration von 80 mg/mL suspendiert und innerhalb von 2 h benutzt, um Versuchstiere zu injizieren. Dieses ursprüngliche Modell verwendet Mäuse im gleichen Alter, vom selben Hersteller Standort, die in ihren jeweiligen Forschungseinrichtungen für weniger als 2 Wochen vor der Ernte cecal Inhalt untergebracht waren. Die Verwendung von eigenen gezüchteten Mäusen beträchtlich obwohl reduzieren die Kosten von Regellieferant Lieferung und damit für die Verwendung von überschüssigen Mäuse einer breiteren Palette von Geschlecht und Alter, auch Spender, Spender Variabilität. Dies motiviert die Entwicklung einer alternativen Technik, wobei cecal Inhalt aus mehreren Mäusen zusammengeführt wurden, einen großen Vorrat vorbereiten, der dann regelmÄÑig und bei-80 ° C13gelagert war. Diese alternative Methode wurde von mehreren Gruppen-14,–15adaptiert. Diese Anpassung führte jedoch einige technische Varianten, sowohl in den Speichermedien verwendet (10 % oder 15 % Glycerin oder D5W allein) und in der Strategie der Filtration um Partikel zu entfernen (mehrstufige Filtration durch ein 860 µm und dann ein 190 µm Filter oder Einzelperson Filtrationen über 100 µm oder 70 µm Filter)13,14,15. Die Injektion von Glyzerin allein könnte potenziell schädigen, angesichts der Tatsache, dass 25 % – 50 % Glycerin Injektionen als Nagetier Modell einer Nierenschädigung16,17,18,19verwendet wurden, 20. Zur Vermeidung von unbeabsichtigten Nebenwirkungen von Glycerin ist die cecal Gülle Stoffaufbereitung für Mäuse in dieser Studie in D5W ohne Glycerin eingefroren, und Tests der bakteriellen Lebensfähigkeit aus dem Speicher bei-80 ° C durchgeführt. Die Filtration-Strategie in dieser Studie verwendet wird, einem Durchgang durch einen 70 µm-Filter, die nicht direkt mit den anderen Filtration Strategien aufgeführt verglichen hat.

Tödliche Gewicht angepasst Dosen injiziert cecal Gülle variieren von Anlage zu Anlage und soll hochinfizierende, um die gewünschte Letalität für einzelne Gruppen. Mit verschiedenen Herausforderung Dosen ändern die begleitende Herausforderung Volumes durch die Notwendigkeit. Jedoch wurde dieses methodischen Detail nicht vor berichtet. Darüber hinaus Strategien für standard-Verfahren, wie z. B. intraperitoneale Injektion sind selten auf innerhalb der Literatur erarbeitet, aber Einzeltechniken können beeinflussen, ob Neugeborene Mäuse lecken wenn Sie injiziert und die Endergebnisse auswirken.

Tierschutz, einschließlich einer Definition des humanen Endpunkt ist ein zentraler Aspekt dieses Modells und in jedem Modell von Infektionen und Entzündungen in Nagetieren21. 1998 veröffentlichte der Canadian Council auf Animal Care (CCAC) umfangreiche Richtlinien für humane Endpunkt Auswahl den humaneren Endpunkt zu definieren, da “alle tatsächlichen oder möglichen Schmerzen, Ängste oder Beschwerden sollten minimiert oder gemildert durch die Wahl der früheste Endpunkt ist kompatibel mit den wissenschaftlichen Zielen der Forschung”22. Andere auch Achtung, dass humane Endpoints feststehen muß auf wissenschaftliche Begründung nicht auf eine subjektive Interpretation des Tieres Staat allein21basiert. Zwar gibt es eine Fülle von Ressourcen für klinische, Verhaltens-, und Körper-Zeichen-basierte Zustandsvorschriften für humane Endpunkt, auch im Rahmen von Infektionen und Entzündungen speziell21,23,24, keines dieser , einschließlich der CCAC Richtlinien für humane Endpunkt22, Neugeborene Mäuse erwähnen. So sind Objektiv und wissenschaftlich begründeten humane Endpoints viel schwieriger für neugeborene Tiere angesichts ihrer begrenzten Verhalten Fähigkeiten und Mangel an Beweisen aus Kriterien wie Gewichtsverlust, die allgemein für Erwachsene verwendet wird Mäuse. Derzeit, die Kriterien für die humane Endpunkt verwendet für 5 bis 12 Tage alten neugeborenen Mäusen in der cecal Gülle Literatur alle wieder mit dem original zu verweisen, die das Modell2eingeführt. In diesem ursprünglichen Papier stützte sich die Definition des humanen Endpunkt für neugeborene Tiere auf zwei Kriterien; nämlich, war die Position der Maus außerhalb des Nestes (Streuung) und der Mangel an Milch Flecken gesehen zu Tod innerhalb von Stunden führen. Erschwerend ist bei der Zuordnung eines humanen Endpunkts, dass Milch Spots werden schwer zu erkennen in Mausstämme mit dunklen Fell, wie z. B. die verwendeten C57BL/6J Belastung nach der ersten Woche des Lebens, während kranke Tiere bis zum 14. Tag des Lebens (DOL) überwacht werden. Weitere, tote Tiere können Postchallenge gefunden werden, wenn diese Kriterien anwenden (eigene Beobachtung unveröffentlicht); so muss eine strengere Definition von humanen Endpunkt auf Versuchstiere leiden zu lindern und vermeiden Sterblichkeit in Situationen, wo das Ergebnis genau früher erkannt werden könnte.

Alle drei methodische Aspekte des Modells cecal Gülle werden in eine Betriebsanweisung Detaillierung der Vorbereitung der cecal Gülle bestand vorgestellt, eine Methode zum Einspritzen von Versuchstieren, die hält die Injektion Volumen konstant zwischen den einzelnen Dosen und reduziert das Risiko von Leckagen und eine Definition der humane Endpunkt für 7 bis 12 Tage alte Mäuse basiert auf einem System von behavioral Modeling. Verhaltensbezogene Informationen Maus Gesundheit Partituren aus über 240 Versuchstieren wurde gesammelt und gruppiert nach endgültigen überleben Ergebnis, demonstriert eine Beweis-driven Definition der humane Endpunkt. Das Leiden von Versuchstieren wird durch moribund neugeborenen Mäusen am frühesten möglichen Zeitpunkt zu identifizieren, während biologisch signifikanten Überlebensvorteil Ergebnisse abgeleitet werden können, durch die Beobachtung Schlüsselvariablen reduziert. Die visuelle Darstellung der cecal Gülle Vorbereitung und neonatale Mausverhalten dient als eine ausgezeichnete Quelle für jede Gruppe, die Sepsis oder Neugeborenen Herausforderung Modell Tiere zu studieren.

Protocol

Alle Experimente in diesem Protokoll wurden von der University of British Columbia Tier Pflege Ausschuss unter Protokollnummer A17-0110 genehmigt. 1. Werkzeug Sterilisation Schalten Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank (BSC) und Heizen Sie die heiße Perle Sterilisator auf 250 ° C, mindestens 30 min vor Gebrauch. Tauchen Sie die Werkzeuge in 70 % igem Ethanol. Tauchen Sie die Werkzeuge in den vorgeheizten heiße Perle Sterilisator für ein Minimum von 1 min.Hinweis: Die Griffe der Werkzeuge werden heiß und können brennen, wenn in den heißen Perle Sterilisator für über 1,5 min übrig. Sprühen Sie eine matte Papier Handtücher mit 70 % Ethanol um sie zu sterilisieren. Die heiße Perle Sterilisator ohne Berührung den sterilisierten Teil des Werkzeugs auf die unsterilen Griffe der anderen untergetauchten Tools Werkzeuge entnehmen und auf das Ethanol besprüht Küchenpapier legen. Warten Sie 30 s bis 2 min für die Werkzeuge zum abkühlen, bevor Sie mit ihnen für die Dissektion. 2. Cecal Gülle Vorbereitung Preweigh 15 mL Zentrifuge Röhren (ein Rohr für alle fünf Mäuse eingeschläfert werden). Einschläfern Sie cecal Gülle Spender nach lokalen Tierpflege Richtlinien oder verwenden Sie das Protokoll unten.Hinweis: Bis zu 40 C57BL/6J Mäuse zwischen 6 und 12 Wochen alten cecal Gülle Vorbereitung, mit bis zu fünf Mäuse wird zu einem Zeitpunkt eingeschläfert dienten. Übertragen Sie die Mäuse an die Euthanasie-Kammer und Isofluran-Anästhesiegerät auf 5 % mit Sauerstoff Perfusion. Überwachen Sie die Mäuse um den Verlust der Fähigkeit zu bewegen und zu sehen, sie betreten das chirurgische Flugzeug der Narkose zu beobachten und schließlich aufhören zu atmen. Entfernen Sie eine Maus aus der Euthanasie-Kammer, Kneifen Sie die Pfote und beobachten Sie jedes Bein einfahren oder Inhalation zu. Wenn entweder vorhanden ist, die Maus zurück an die Euthanasie-Kammer; Andernfalls fahren Sie fort. Unheilbar einschläfern Sie die Mäuse durch scharfe zervikale Dislokation. Führen Sie Blinddarm Dissektion mit Elektrodenspitzen und gekühlten Werkzeugen (siehe Abschnitt 1) in einer BSC. Heften Sie die Beine der Maus zu einem extrudierten Polystyrol-Hartschaum-Board mit 23 G Nadeln, so dass die Maus seinen Bauch sich hat an. Sichern und dann den Bauch mit 70 % Ethanol sprühen. Mit sterilen Zange und Schere, Schnitt durch die Haut, die Haut von der peritoneale Auskleidung mit der Schere und aufgeschnitten einen rechteckigen Bereich von Leiste zum Brustbein und links nach rechts zu lösen. Entfernen Sie alle Fell aus das Bauchfell. Wechseln Sie in ein neues Paar sterile Instrumente durch das Peritoneum, machen eine rechteckige Öffnung, wie für die Haut, Werkzeugwechsel wenn diejenigen Kontakt verwendet die Haut geschnitten. Identifizieren der Blinddarm, die links nach rechts über den Körper laufen sollte. Bindegewebe um den Blinddarm Zweigen aus dem Darm zu identifizieren und Schneiden der Blinddarm entfernt von den Därmen zu stören. Ort der Blinddarm auf einem sterilisierten Blatt Papier wiegen.Hinweis: Mit einem Gewicht von Papier kann entweder durch Besprühen mit 70 % igem Ethanol auf beiden Seiten und lassen es trocknen oder durch UV-Bestrahlung sterilisiert werden. Alternativ kann der Blinddarm auf einem sterilen Petri Teller seziert werden. Cecal Inhalt extrusion Eine BSC verwenden Sie sterile Instrumente zu beiden Enden der Blinddarm durchschneiden. Halten Sie Mitte der Blinddarm mit der sterilen Pinzette und verwenden Sie eine flache sterile Metallspatel, sanft drücken die cecal Inhalte aus dem Schnitt endet, mit einem abrollen und Vermeidung einer Schaben Bewegung, die das Epithel reißen könnte. Sammeln Sie die Inhalte und legen Sie sie in ein preweighed 15 mL Zentrifugenröhrchen. Bündeln Sie die cecal Inhalte von maximal fünf Mäuse in die gleiche Röhre. Wiegen Sie das Rohr wieder, nachdem alle Inhalte hinzugefügt wurden.Hinweis: Erwarten Sie einen Durchschnitt von 300 mg, und bis auf 390 mg cecal Gülle per Mausklick, dass 1,8 bis 2,4 mL D5W für Wiederfreisetzung per Mausklick; Daher kann mit mehr als fünf Mäuse während dieses Schritts in der 15 mL Zentrifugenröhrchen Überfüllung führen. Wischen Sie die Werkzeuge mit einer Ethanol-gesprüht Papiertuch reinigen und restilisieren sie durch Wiederholen der Schritte 1,2-1,6. Cecal Gülle filtration Wiegen Sie die Zentrifugenröhrchen mit cecal Inhalt gefüllt und berechnen Sie die Höhe der D5W cecal Inhalt hinzu, indem man das Gewicht des cecal Inhalts durch die gewünschten Lager Konzentration in Milligramm pro Milliliter, wie in der folgenden Gleichung. Die erforderliche Menge an eiskalten D5W Hinzufügen einer BSC die 15 mL Zentrifugenröhrchen mit dem cecal Inhalt. Wirbel der 15 mL Zentrifugieren Rohr vertikal und horizontal 30 S. Check für Partikel von mehr als 1-3 mm im Durchmesser und falls vorhanden, vortexen fortgesetzt, bis alle großen Partikel sichtbar verschwunden ist. Legen Sie ein steriles 70 µm Zelle Sieb in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gelegt wird. Pipette 4 mL resuspendierte cecal Gülle in die Zelle Sieb und dann zu dem Sammelrohr. Aufzuwirbeln Sie die Partikel durch Pipettieren rauf und runter x-3 2-Fach. Extrudieren Sie sanft Luftblasen um die Filterung Geschwindigkeit rühren Sie den Inhalt mit der Pipettenspitze bis gibt es keine mehr Tröpfchen gefiltert zu erhöhen.Hinweis: Beim Mischen, möglicherweise Partikel groß genug, um 5-mL-Pipette anschließen. In diesem Fall wiederholen Sie den Vortexen aus Schritt 2.5.3, und wenn die Lösung noch nicht auseinander bricht, verwenden Sie die Pipette die Partikel an der Wand die Zentrifugenröhrchen drücken. Wiederholen Sie Schritt 2.5.4, ändern Zelle Siebe zwischen jedes Rohr cecal Gülle und Pool alle Inhalte in der gleichen 50 mL Sammlung Zentrifugenröhrchen auf Eis gehalten oder in eine zweite 50 mL Zentrifugenröhrchen übersteigt das Volumen der das Filtrat die Eis-Ebene in der Eisbox. Aliquoten cecal Gülle. Ggf. kombinieren Sie mehrerer 50 mL cecal Gülle Filtrat Rohre aus Schritt 2.5.5 in einen größeren sterilen Behälter (z. B. ein 1.000 mL Vorratsflasche). Anschließend Wirbel für 15 s und Platz 20 mL in einem neuen 50 mL Zentrifugenröhrchen. Wirbel der cecal Gülle bestand, der ist in der 50 mL Zentrifugenröhrchen für 5-10 s und aliquoten 500 µL in kryogenen drei 2 mL-Fläschchen, die Gummidichtung, um Verdunstung im Laufe der Zeit zu verhindern. Legen Sie sofort zum Meister und regelmÄÑig kryogenen Fläschchen auf Eis. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.1 und 2.6.2 bis alle cecal Gülle wurde regelmÄÑig, Aufschütteln der Meister bestand nach allen drei Kryogen Fläschchen um zu verhindern das Absetzen von jeder Partikel und eine homogene Mischung zu erhalten. Einfrieren der cecal Gülle Aliquote bei-80 ° C.Hinweis: Zwischen drei bis vier Lager Fläschchen bei 500 µL von jedem erwachsenen Maus erwarten. Jedes Lager Fläschchen sollte grob genug Herausforderung einem Wurf von acht Mäusen bei DOL-7. (3) Sepsis Herausforderung von 7 Tage alten neugeborenen Mäusen Trennen Sie, identifizieren Sie und wiegen Sie Neugeborener Mäuse. Eine BSC übertragen Sie die neugeborenen Mäusen zu einem neuen Käfig, die Mäuse von den Damm zu halten und zur Verringerung der Belastung bis zum Staudamm. Entfernen Sie und reiben Sie Bestandteil der Nistmaterial mit Handschuhen, den Käfig Geruch auf die Handschuhe zu übertragen. Dann Schimmel das Nistmaterial in einem kleinen Nest und legen Sie sie in einen neuen Käfig ohne den Damm. Übertragen Sie die Neugeborenen Mäuse auf das Nistmaterial in den neuen Käfig. Übertragen Sie mehr Nistmaterial um eine zweite, leere Nest in den neuen Käfig zu machen. Schließen Sie und entfernen Sie die dam Käfig von der Haube, so dass der Damm nicht betont wird, die Neugeborenen Mäuse Not zu hören. Um einzelne neugeborenen Mäusen innerhalb des Wurfes im Laufe der Zeit zu verfolgen, benutzen Sie einen Ethanol-Beweis-Marker um ein bis fünf Punkte auf der Vorder- oder Rückseite des Hecks, erneute Anwendung alle 12-24 h, je nach Bedarf zu markieren. Wiegen Sie jede Maus, die wird in Frage gestellt werden, platzieren jeweils in die sekundäre nisten nach dem wiegen, und wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse. Den ganzen Wurf bis zum Staudamm vor der Zubereitung der aliquoten cecal Gülle Herausforderung zurück. Gewicht angepasst Einzeldosen von cecal Gülle und erforderliche Verdünnung mit D5W berechnen, indem Sie diesen Schritt für jeden Wurf separat abgeschlossen, über die Berechnungen unter oder über dem angegebenen Arbeitsblatt (siehe Ergänzende Datei). Berechnen Sie Milligramm (ein) cecal Gülle zu jeder Maus verabreicht werden, indem man das Gewicht der Maus in Gramm (b) multipliziert mit der gewünschten Herausforderung Dosis in Milligramm cecal Gülle pro Gramm Maus (c). Berechnen Sie die individuelle Lautstärke des unverdünnten cecal Gülle bestand erforderlich per Mausklick in Mikroliter (d) durch Division der Milligramm cecal Gülle pro Maus aus Schritt (ein) 3.2.1 benötigt durch die Konzentration Lager cecal Gülle, 160 mg cecal Gülle pro Milliliter D5W (e), multipliziert mit 1.000 µL pro Milliliter Milliliter in Mikroliter konvertieren. Durchschnitt der Aktien cecal Gülle pro Maus (g) notwendig durch Summierung der Lagervolumen cecal Gülle (d) per Mausklick in einem Wurf n Mäuse, geteilt durch die Anzahl der Mäuse (n). Berechnen Sie den durchschnittliche Verdünnungsfaktor für den cecal Gülle bestand (h) durch Division der durchschnittliche Injektionsvolumen (100 µL) durch Lager Durchschnittsvolumen cecal Gülle pro Maus (g). Berechnen jede Maus bestimmten Injektionsvolumen in Mikroliter (j) jede Maus Volumen der Lager cecal Gülle erforderlich (d) mit der durchschnittlichen Verdünnungsfaktor (h) multipliziert und dann auf die nächsten zehn Runden (entsprechend der 10 µL Schritten von der Injektionsspritze). Berechnen Sie die durchschnittliche erforderliche Menge D5W zum Verdünnen des cecal Gülle bestand (k) durch Subtraktion den durchschnittliche cecal Gülle bestand (g) von der durchschnittlichen Injektionsvolumen (100 µL). Berechnen Sie den Gesamtbetrag der cecal Gülle bestand im Mikroliter (l) durch Multiplikation der durchschnittlichen Lager cecal Gülle per Mausklick in Mikroliter (g) durch die Anzahl der Mäuse in diesem Wurf (n) und Multiplikation mit 1.4 zusätzliche erstellen. Den Gesamtbetrag der D5W in Mikroliter (m) erforderlich, um den cecal Gülle bestand zu verdünnen, multipliziert die durchschnittliche erforderliche Menge D5W zu berechnen (k) durch die Anzahl der Mäuse (n) und Multiplikation mit 1.4 zusätzliche erstellen. Bereiten Sie die Herausforderung Aliquot nach der Berechnung der Menge an Lager cecal Gülle erforderlich (l aus Schritt 3.2.7). Eine BSC tauen Sie die erforderliche Anzahl von cecal Gülle Lager Fläschchen bei Raumtemperatur, Pipettieren seinen Inhalt zu mischen. Gibt es nicht mehr sichtbar Eiskristalle in der aufgetauten cecal Gülle vorhanden, überweisen Sie den berechneten Betrag cecal Gülle bestand (l aus Schritt 3.2.7) zu einem sterilen 1,8 mL Microcentrifuge Schlauch. Verdünnen der erforderlichen Konzentration durch Zugabe von eiskalten D5W wie in Schritt 3.2.8 (m) berechnet. Speichern Sie die Herausforderung Aliquoten auf Eis. Vor dem Einlegen der Spritze, mischen die Microcentrifuge Schlauch durch streichen es 20 X, gefolgt von 3 X der Erstellung und Vertreibung von 300-500 µL cecal Gülle mit einer 500 cc 28 G ½ Zoll Insulin Spritze. Rund 150 µL verdünnter cecal Gülle in derselben Spritze aufstellen. Streichen Sie die Spritze um Luftblasen aus den Kolben zu entfernen, ziehen Sie leicht zurück auf die Spritze und dann vertreiben die Bläschen. Verzichten Sie überschüssige cecal Gülle zurück in den Microcentrifuge Schlauch bis die richtige Menge an cecal Gülle für eine Maus, wie berechnet wurde, für individuelle Mäuse im Schritt 3.2.5 (j), ist in der Spritze geladen. Intraperitoneal injizieren Sie cecal Gülle nach relevanten lokalen Tierpflege Institution Richtlinien zu, oder verwenden Sie die unten beschriebenen Schritte. Eine BSC trennen Sie die Neugeborenen Mäuse vom Damm aus wie unter Punkt 3.1 beschrieben. SCRUFF die Maus von der Rückseite des Halses, mit Daumen und Zeigefinger. Sichern Sie die Maus Rute über den Rücken der Mittel- und Ringfinger oder auf der Vorderseite der Ring und Pinky Finger. Zur Minimierung von Leckagen neigen Sie die Neugeborene Maus so, dass es nach unten zeigt und einsetzen Sie die Nadel Abschrägung der Nadel nach oben, zwischen die Beine und den Genitalien, halten die Nadel flach und subkutane. Wenn die Nadel 1 cm eingefügt wird, drücken Sie nach unten und nach vorne, um die Nadel durchstechen das Peritoneum zu fühlen. Drücken Sie langsam den Kolben, die Spitze der Nadel so ruhig wie möglich zu halten, seitliche Bewegungen der Maus Organe beschädigen können. Ziehen Sie die Nadel heraus sorgfältig über 5-10 s, nach den gleichen Weg, wie in den Mittelfinger während des Entfernens Spannungen in der Maus Körper entspannen. Um die Dichtheit zu überprüfen, halten Sie die Maus für ein paar Sekunden nach dem Entfernen der Nadel, um Zeit für die Injektionsstelle zu schließen, und beobachten Sie Undichtigkeiten oder Vorwölbung an der Injektionsstelle, an welcher, die Stelle die Maus nicht in der Analyse verwendet werden soll.Hinweis: Vorwölbung der Haut an der Injektionsstelle eine fehlgeschlagene intraperitoneale Injektion mit der Eindüsungsluft als subkutane zeigt. Platzieren Sie den Mauszeiger auf ein Papiertuch und lassen Sie die Maus, um einen Schritt zu tun. Wenn die Maus unbeweglich für 5 s, dann drücken Sie die Rute. Heben Sie die Maus, und überprüfen Sie auf Undichtigkeiten cecal Gülle an der Injektionsstelle. Wenn ein Leck vorhanden ist, die Maus von der Analyse auszuschließen und die Maus einschläfern. (4) Maus Überwachung Überwachen Sie die Mäuse regelmäßig, um sie zu überprüfen, für eine humane Endpunkt angekommen. Beobachten Sie die Mäuse 2 h Postchallenge für jede Injektion-Komplikationen. Die Mäuse 12 h Postchallenge Sepsis-bezogenen Morbidität sowie die Festlegung von Mäusen an eine humane Endpunkt zu überwachen (siehe Schritte 4.2 4.3 Kriterien). Anschließend überwachen Sie alle 4-6 Std. für die ersten 2 Tage, mit Ausnahme von 8 h über Nacht, wenn die Neugeborenen Mäuse unbeaufsichtigt sind. Überwachen Sie über 2 Tage Postchallenge x-2 1 X pro Tag. Wenn Kranke Mäuse oder Mäusen verringert sich deren Integritätswert eingehalten werden, dann erhöhen Sie die Überwachung Frequenz auf alle 4-6 h. Überwachung von neugeborenen Mäusen Für jedes Verfahren mit Neugeborenen Mäusen, übertragen die Bettwäsche Material zu einem neuen Käfig wie unter Punkt 3.1 beschrieben (aus den gleichen Gründen wie erwähnt dort). Überprüfen Sie für alle Neugeborenen, die aus dem Nest beim Stillen gezogen sind. Alle Mäuse, die aus dem Wurf gezogen werden, während Pflege nicht gelten sollte, Mäuse verteilt werden. Beim Entfernen von oben auf das Nest identifizieren Streuung von neugeborenen Mäusen entweder vom Nest oder stecken in dem Nistmaterial aber weg von ihren Wurfgeschwistern, mit Ausnahme von Mäusen gezogen vom Wurf beim Stillen. Beziehen sich auf die humane Endpunkt, den Kriterien im Schritt 4.5 Wenn eine Maus gefunden wird verstreut. Messen Sie die Mäuse aufrichtendes Reflexe und Mobilität. Auf ein Papiertuch legen Sie eine Maus auf dem Rücken und für seine Fähigkeit, sich innerhalb von maximal 4 rechts überwachen s. Wenn auf den Rücken gelegt, fällt die Maus entweder links oder rechts, was ist, wenn die Anzahl der 4 s beginnt.Hinweis: Um in die “Rechte” Gruppe eingeteilt werden, die Maus muss in der Lage sein, um wenigstens drei von vier Pfoten-Pads auf dem Papiertuch für 1 s. Es ist nach wie vor als in der Lage, sich richtig, wenn es umfällt gruppiert. Wenn die Maus sich richtig kann, dann warten Sie 8 s auf ihre Mobilität. Kategorisieren Sie die Maus als “Rechte-Mobile”, wenn es selbst gerade und seine Umgebung erkunden, durch mehrere Schritte hintereinander kann. Kategorisieren Sie die Maus als “Rechte-trägen”, wenn es selbst gerade und ein paar Schritte Unternehmen, um seine Umgebung zu erkunden kann. Die Mäuse in dieser Gruppe können umfallen und dabei einen Schritt suchen Sie wackelig auf den Beinen und pause zwischen den einzelnen Schritten. Kategorisieren Sie die Maus als “Rechte-Nonmobile”, wenn es selbst richtig kann aber sich nicht viel herum bewegt. Es kann immer noch umfallen, und wenn es keine Schritte innerhalb von 8 s, es wird als Rechte-Nonmobile gruppiert. Wenn die Maus sich nicht Recht konnte, seine Mobilität anhand der beobachteten Hüftbewegung zu kategorisieren.Hinweis: Vermeiden Sie wiederholen die Überwachung oder Erhöhung der Länge, die die Maus auf dem Rücken verbringt, weil dies die scoring-System und humane Endpunkt beeinträchtigen könnte, wie eine Maus, die sich innerhalb von 4 s kann manchmal recht nicht tun, wenn mehr Zeit zur Verfügung. Kategorisieren Sie die Maus als “Fail nach rechts (FTR)-Mobile” Wenn es nicht in der Lage, sich richtig und zeigt Hüftbewegung, die 90 °-Winkel von der horizontalen überschreitet. Einige Mäuse können sich rechts, wenn mehr als 4 s, aber immer noch als FTR, mit Mobilität Resultate anhand der Hüftbewegung kategorisiert werden sollen. Kategorisieren Sie die Maus als “FTR-trägen”, wenn es nicht in der Lage, sich richtig und Hüftbewegung unter 90°-Winkel von der horizontalen zeigt. Die Maus als “FTR-Nonmobile”, wenn es nicht in der Lage, sich richtig und hat Beine, die rütteln oder vibrieren aber keine Hüftbewegung zu kategorisieren. Glieder können erweitern oder zurückziehen, aber nicht haben seitliche Bewegung. Die Maus ist sichtlich krank und humaneren Endpunkt erreicht hat. Wiederholen Sie Schritt 4.3 auf der anderen Seite der Maus, Aufzeichnung von beiden Seiten.Hinweis: Siehe Ergänzende Datei für die Aufzeichnung von Beobachtungen. Bestimmen Sie, ob die Maus an eine humane Endpunkt und Euthanasie erfordert wie in Tabelle 1und unten beschrieben. Kategorisieren Sie Mäuse in verschiedenen aufrichtenden und Mobilität auf Grundlage der Überwachung Beobachtungen in den Schritten 4.3 und 4.4. Die Maus Mobilität wird für jede Seite gemessen, und die mobile Verhalten wird verwendet, um festzustellen, ob die Maus Euthanasie erfordert. Weisen Sie keine Mäuse mit einem aufrichtenden reflex entweder (a) FTR-Nonmobile oder (b) FTR-lethargisch und gefundenen getrennt aus dem Nest in eine humane Endpunkt sein. Klassifizieren Sie bei der Überwachung der Zeitpunkte über 20 h Postchallenge Maus mit einem aufrichtenden Reflex “Fail nach rechts” auf beiden Seiten als eine humane Endpunkt, weil die dargestellten Daten mit hoher Genauigkeit vorhersagen, dass diese Mäuse schließlich Krankheit zu erliegen, und nicht wiederhergestellt werden. Separate Mäuse, die eingeschläfert werden, da im Schritt 4.5 ermittelt. Die überwachten Maus sieht nicht wie eine humane Endpunkt, legen Sie sie in das zweite leere Nest in den neuen Käfig ohne den Damm, und fahren Sie mit den anderen neugeborenen Mäusen. Sobald der gesamte Wurf beobachtet wurde, bewegen Sie die Hälfte das Nistmaterial in den Käfig mit dem Staudamm, ein Nest in der Mitte Platz für die neugeborenen Mäusen zu reformieren.Hinweis: Eine falsch geformte Nest könnte die Mäuse zu streuen und reduzieren die Menge der verfügbaren Pflege, die der Damm anbieten kann. Übertragen Sie die neugeborenen Mäusen zurück in den Käfig mit dem Damm. Umschließen Sie den Wurf im Nest, indem die übrig gebliebenen Nistmaterial über die Streu und sanft Kneifen es rund um den Deckel, die Nistmaterial im Ort zu sichern. Einschläfern Sie die Neugeborenen Mäuse getrennt im Schritt 4.6 lokale Institution bedarfsgerecht. (5) Titration cecal Gülle Fordern Sie die Mäuse in der gewünschten Herausforderung Dosis (Abschnitt 3) und überwachen Sie die Ergebnisse (Abschnitt 4). Beobachten Sie, ob das Endergebnis ergibt sich die gewünschte LD, und wenn nicht, wiederholen Sie die Abschnitte 3 und 4 mit einem neuen Wurf in einer höheren oder niedrigeren Herausforderung Dosis, Anpassung um 5 % – 10 %.Hinweis: Herausforderung Dosen können ähnlich wie Abbildung 1 b aber hochinfizierende in jeder Einrichtung und Stamm von Mäusen sein müssen. Beachten Sie auch, ob die Mäuse einen humaneren Endpunkt schneller oder langsamer als die erwartete Kinetik in Abbildung 1 b erreichen, und wiederholen Sie die Abschnitte 3 und 4 mit einem neuen Wurf in einer höheren oder niedrigeren Herausforderung Dosis, Anpassung um 5 % – 10 %.

Representative Results

Cecal Gülle Lebensfähigkeit bei-80 ° C gelagert kann im Laufe der Zeit getestet werden durch seriell verdünnen und Plattieren Aliquote cecal Gülle bestand auf 5 % Schafe tryptic Soy Blutagar gefolgt von 24 Stunden nach der aeroben Inkubation bei 37 ° C. Nachfolgende Auszählung der kultivierbaren koloniebildenden Einheit (KBE) Inhalt einer cecal Gülle Zubereitung fand sich nicht, um über einen Zeitraum von 6 Monaten zu ändern, und die Lebensfähigkeit von längerer Lagerung bei-80 ° C (Abbildung 2) nicht betroffen war. Jeder Spender Maus führte im Durchschnitt genügend cecal Gülle, drei bis vier Würfe (Daten nicht gezeigt) herauszufordern. Mäuse vor der Herausforderung, im DOL 7 cecal Gülle induzieren Biofilm Sepsis begannen die humaneren Endpunkt innerhalb von 12 h der Herausforderung zu erreichen und Biofilm Sepsis wurde meist von 48 h Postchallenge gelöst, wie in einer Kaplan-Meier-überleben-Kurve kombiniert aus beobachtet Daten von über 200 Behinderte Mäuse (Abbildung 1A). Die Letalität war abhängig von der Herausforderung Dosis verabreicht, mit einer 5 % Änderung der Herausforderung Dosierung führt ein ca. 15 % Unterschied in der Überlebensrate (Abbildung 1 b). Die Maus-Körpergewicht wurde bei jeder Nachprüfung gemessen. Gewichtsabnahme galt bei allen behinderten Tieren, wird nicht diskriminierenden zwischen Mäusen, die Überlebenden am Ende und diejenigen, die nicht während der ersten 24 h (Abbildung 1) postchallenge. Nach 24 h begann die meisten Überlebenden Tiere, ihr Gewicht wieder zu erlangen, während alle Nonsurvivors weiterhin Gewicht zu verlieren und ihre humane Endpunkt verschoben. Aber ein kleiner Anteil der Überlebenden Tiere, die behielt ihre aufrichtenden Reflex auch weiterhin Gewicht zu verlieren oder versäumt, Gewichtszunahme, bis zum Ende des Experiments, sogar weniger als 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts innerhalb von 40 h der Herausforderung zu verlieren hatte. Da gab es eine Überschneidung der Gewichtsverlust zwischen Mäusen, die Überlebenden am Ende und diejenigen, die nicht tat, konnte die Änderung im Gewicht oder eine Schwelle der Gewichtsabnahme nicht als Kriterium für humane Endpunkt verwendet werden und gleichzeitig das Ziel der Aufteilung genau Überlebenden von Nonsurvivors. Das Verhalten von Mäusen wurde überwacht, wie im Protokoll und in Tabelle 2dargelegt. Schnappschüsse von der Gesundheit, die Kategorien werden angezeigt (Abbildung 3A-C). Diese Fotos zeigen den verschiedenen gesundheitlichen Kategorien von Mäusen nicht gleich sich danach auf den Rücken gelegt und den Unterschied zwischen FTR-Mobile und FTR-lethargisch, zu skizzieren, das ist ein wichtiger Unterschied. Unangefochtene gesunde Mäusen in diesem Alter anzeigen nicht FTR-lethargisch Aktivität; Daher ist diese Kategorie Gesundheit ein Marker für Krankheit und eine Antwort auf die Herausforderung. Krank Mäuse FTR-lethargische Symptome (Abb. 3 b) und könnte regress gegenüber FTR-Nonmobile (Abbildung 3), wo die Oberschenkel parallel mit dem unteren Bein bleibt, ist mit wenig bis Null Hüfte schaukelte Bewegung, die eines der Kriterien für humane Endpunkt. Die Mäuse könnten auch erholen, erhöhte Hüftbewegung zu gewinnen und immer FTR-Mobile (Abb. 3A). Der aufrichtenden Reflex und Mobilität Partituren wurden für Links und rechts von jeder Maus bestimmt, und die höchste Punktzahl wurde eingesetzt, um festzustellen, ob die Maus einen humaneren Endpunkt erreicht hatte. Verhaltensbezogene Informationen wurde aus über 240 Tiere vor der Herausforderung, einer tödlichen Dosis (LD60) 60 cecal Gülle gesammelt, und 144 humane Endpunkte wurden beobachtet (Abbildung 3D-F und Tabelle 1). Diese Beweise orientierter Ansatz wurde verwendet, um zu definieren und verfeinern die humaneren Endpunkt über vier Krankheitsstadien, kategorisiert durch die Experimentatoren basierend auf beide Verhaltensunterschiede zwischen Überlebenden und Nonsurvivors und mit dem Bruch der humane Endpunkte erreicht in jedem Zeitraum. Während der frühen Experimente fanden sich FTR-Nonmobile-Mäuse, die kein Hüftbewegung hatte konsequent tot innerhalb von 4-6 h für dieses Verhalten zu beobachten. In der Sammlung von Informationen war ein FTR-Nonmobile Integritätswert als Kriterium für eine humane Endpunkt verwendet. Von 12-21 h Postchallenge während FTR-Nonmobile Mäuse euthanasiert wurden, Überlebenden und nonsurviving Tiere sehr ähnliche Verhaltensmuster angezeigt und könnte nicht in irgendeiner anderen Weise (Abbildung 3D) unterschieden werden. Vom 21-48 h Postchallenge die Mehrheit der Überlebenden Mäuse wieder ihre aufrichtenden Reflex, während weniger als 1 % der FTR Verhaltensweisen beobachtet wurden bei Tieren, die würde überleben das Experiment (Abbildung 3E). Mäuse, die sich von beiden Seiten rechts wurde somit ein zusätzliches Kriterium für humane Endpunkt während dieser Zeit. Zwischen 12 und 20 h Postchallenge 12,5 % an der Gesamtzahl der humane Endpoints, im Vergleich zu 80,5 % zwischen 20 und 48 h und 7 % nach 48 h (Tabelle 1) beobachtet. Ein Unterscheidungsmerkmal zwischen Mäusen, die Überlebenden landeten und das verschlechterte sich schließlich auf eine humane Endpunkt war der Verlust der aufrichtenden Reflex, unabhängig von hip Mobilität (Abbildung 3F). In der Tat konnte insgesamt 121 Mäuse zwischen 20 und 48 h nach der Herausforderung, nach rechts sich von beiden Seiten mit 116 dieser Mäuse schließlich voran an eine humane Endpunkt (das entspricht eine 96 % Genauigkeit bei der Ermittlung von Mäusen, die nicht wiederhergestellt werden würde). Über 48 h nach der Herausforderung waren 11 Mäusen beobachtet, zum Scheitern verurteilt, sich von beiden Seiten und 10 von diesen progressiven um eine humane Endpunkt (eine 91 % Genauigkeit) gleich. Über 20 h nach der Herausforderung sagt die Anzahl der Mäuse, die für beide Seiten den aufrichtenden Reflex verloren das endgültige Ergebnis mit einer Genauigkeit von mehr als 90 %; Daher hat dies hinzugefügt, um die humane Endpunkt Kriterien, nonrecovering Mäuse früher zu identifizieren und zu reduzieren Maus leiden (Tabelle 1). Die Häufigkeit, dass Mäuse Überwachung brauchen ändert sich im Laufe der Zeit durch verschiedene Sätze von Tod Postchallenge, und sind in Tabelle 1zusammengefasst. Eine Maus galt bei seiner humanen Endpunkt an jedem beliebigen Punkt wenn es versäumt, sich richtig angezeigt nicht mobile Hüftbewegung auf beiden Seiten, oder wenn die Maus aus dem Nest, verstreut war konnte sich rechts und lethargisch Hüftbewegung. Mäuse mit eine der folgenden Bedingungen nicht zu erwarten waren, dass man wieder die Streu und innerhalb von 4-6 h Beginn 20 h nach der Herausforderung zu FTR-Nonmobile eingehalten worden, wurde ein neue humane Endpunkt hinzugefügt, weil die präsentierte Informationen, dass die überwiegende zeigt Mehrheit der Mäuse, die FTR von beiden Seiten landet Krankheit zu erliegen. Videos, Tabellen und Ressourcen präsentiert in dieser Handschrift sind eine effektive Lehrmaterial für die korrekte Zuordnung der behavioral herausgefordert Mäuse. Sieben Experimentatoren wurden gebeten, das Training Video und lesen das Protokoll und die Tische vor 60 Behinderte Tiere Verhalten zuweisen. Die Identifikation des humanen Endpunkt-Zuordnung war präzise sowohl für Unterscheidung FTR-Nonmobile-Mäuse von Mäusen, die die andere Verhaltensweisen (Abb. 4A) angezeigt und FTR Mäuse von Mäusen, die sich gerade innerhalb der zulässigen Zeitrahmens (konnten Abbildung 4 b). Abbildung 1 : Kaplan-Meier überleben Kurve cecal Gülle Dosistitration und Gewichtsveränderung nach cecal Gülle Foulspiel. (A) überleben Ergebnis der neonatalen C57BL/6J Mäuse mit einer intraperitonealen cecal Gülle-Injektion bei DOL 7 in Frage gestellt. Die Daten für diese Figur verbanden sich aus unabhängigen Experimenten mit mehreren Herausforderung, die Dosen, von 0,7 bis 1,3 mg cecal Gülle pro Gramm Körpergewicht auf diesen Mäusen verabreicht wurde. (B) neugeborenen Mäusen herausgefordert mit 0,80 bis 0,95 mg pro Gramm Körpergewicht cecal Gülle aus einem cecal Gülle Präparat zeigt eine dosisabhängige Beziehung zwischen der Menge an cecal Gülle gegeben und den Prozentsatz des Überlebens. ()C) den Prozentsatz der Änderung im Vergleich zu der Herausforderung Gewicht mit der gepunkteten Linie bezeichnet eine 20 % Gewichtsverlust aus der Zeit der Herausforderung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 : KBE-Konzentration im cecal Gülle bestand bei-80 ° C gelagert wird nicht über einen Zeitraum von 6 Monaten geändert. Der Effekt des Alters cecal Gülle auf CFU Konzentration wurde getestet mit linearen Regression. Jeder Punkt entspricht einem aliquoten der gleichen cecal Gülle Zubereitung, seriell verdünnt und über einen Zeitraum von 6 Monaten überzogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Hüft-Mobilität Kategorien von Mäusen, die nicht selbst direkt und tierische Verhaltensweisen zu verschiedenen Zeitpunkten Postchallenge. Mäuse, die mit Sepsis, angefochten worden, wenn Sie auf dem Rücken platziert zeigt Anzeichen von Morbidität, die gemessen werden kann durch den Grad der Hüftbewegung. (A) A scheitern nach rechts (FTR)-Mobile Maus zeigt hip Schaukelbewegung ihre Oberschenkel von mehr als 90 °-Winkel von der horizontalen. (B) ein FTR-lethargisch Maus zeigt Hüfte schaukelte Bewegung aber nicht mehr als 90 °-Winkel von horizontal zu jedem Zeitpunkt während der 4 s der Überwachung. (C) einige FTR-Nonmobile Mäuse verlängert das Bein am Knie biegen aber zeigt sehr wenig (weniger als 10 ° Winkel) auf Null Hüfte schaukelte Bewegung und die Beine bleiben parallel zueinander. (D) tierische Verhaltensweisen 12-21 h Postchallenge zeigen, dass nur FTR-Nonmobile Verhaltensweisen Überlebenden von Nonsurvivors zu trennen. (E) vom 21. bis 48 h Postchallenge, nur 4 von 592 beobachteten FTR Verhaltensweisen (0,67 %) gehören für die Überlebenden, so dass der aufrichtenden Reflex auf das endgültige Ergebnis Vorhersagen und als ein neues Kriterium für humane Endpunkt verwendet werden. (F) über 48 h Postinfection, 6 von 131 Mäuse (4,55 %), die einen aufrichtenden Reflex hatte fuhr fort, die FTR-Gruppe gehören und durch das Ende des Experiments, rechtfertigen dauerhafte Überwachung im Laufe der Genesung geopfert wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Lehr-Ressourcen führen, genaue Verhaltens Einstufung von unabhängigen Experimentatoren. Experimentatoren trainiert von Viedeo begleiten dieses Protokolls Videos von 60 neugeborenen Mäusen in verschiedenen gesundheitlichen Gruppen kategorisiert. (A) die Fähigkeit, einen humaneren Endpunkt zu unterscheiden war entschlossen und durchschnittlich 97 % der Verhaltensweisen war genau kategorisiert als FTR-Nonmobile oder nicht, während nur 1 % der FTR-Nonmobile Mäuse identifiziert wurden. Zwei Prozent der Mäuse wurden fälschlicherweise als FTR-Nonmobile identifiziert. (B) die Identifizierung des zweiten humane Endpunkts Criterium korrekt zu unterscheiden zwischen FTR Mäuse oder diejenigen, die die Fähigkeit, sich innerhalb von 4 rechts s wird auf dem Rücken platziert in 97 % der Besetzungen, während nur korrekt zugewiesen wurde 0,96 % der Mäuse wurden falsch zugeordnet, als sich aufrichtenden und 2 % der Mäuse wurden fälschlicherweise als FTR zugeordnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Stadium der Erkrankung A: hohe Morbidität, keine Mortalität B: hohe Morbidität, geringe Mortalität C: hohe Morbidität, hohe Sterblichkeit D: niedrige Morbidität, niedrige Mortalität Stunden post-Herausforderung 0−12 12−20 20−48 > 48 Monitoring Häufigkeit 2 h Post Herausforderung alle 4−6 h Alle 4−6 h, 8 h, unbeaufsichtigt über Nacht 1−2 Mal mehr täglich, bei Bedarf Anteil der gesamten humane Endpunkte beobachtet 0/144 18/144 116/144 10/144 Prozentsatz der humane Endpunkte beobachtet 0 % 12,5 % 80,5 % 7 % Humane Endpoint-Kriterien 1. FTR−Nonmobile auf beiden Seiten 1. FTR−Nonmobile auf beiden Seiten (2) verstreut vom Nest und ist FTR−Lethargic (2) verstreut vom Nest und ist FTR−Lethargic (3) FTR links oder rechts (mit einem Ergebnis der Mobilität) Tabelle 1: Häufigkeit der Überwachung und humane Endpoint-Kriterien in den verschiedenen Stadien der Krankheit. Monitoring Häufigkeit, humane Endpunkte beobachtet, den Prozentsatz der humane Endpoints und humane Endpunkt Kriterien während der verschiedenen Stadien der Krankheit. Aufrichtenden Reflex Mobilität Frist nach rechts nach Ihrem Eingang auf Rückseite Zeitliche Begrenzung für Maßnahme Betrag der Bewegung (mobile / lethargisch / nicht Mobile) Mobilität-Bewertungskriterien Rechte Mobile 4 s Eine zusätzliche 8 s Die Maus nimmt mehrere Schritte hintereinander, Vorwärtsbewegung, Aufrechterhaltung und erkundet die Umgebung. Welpen umfallen nicht. Lethargisch Die Maus kann einen Schritt aber stoppen und anhalten vor der Einnahme von anderen. Welpe kann Umfallen. Nonmobile Die Maus nimmt keine Schritte nach sich aufrichtenden. Welpe kann Umfallen. Scheitern nach rechts Mobilen Hüften Die gleichen 4 s zur Messung der aufrichtenden Reflex Hat energetische Hüftbewegung mit dem oberen Bein drehen über 90° von der horizontalen mindestens einmal innerhalb von 4 s. Lethargisch Hüften Hüftbewegung bis zu aber nicht über 90° von der horizontalen. Nicht mobile Hüften Gliedmaßen durch die Verlängerung und zurückziehen bewegen können aber die Hüfte dreht sich nicht. Welpe sieht sehr krank. Tabelle 2: Überwachung von Tabelle und Kriterien bei der Bestimmung der Integritätsstatus von Mäusen. Die zur Verfügung gestellten Kriterien dienten, Gesundheit Kategoriegruppen Mäuse zu definieren und zu individuellen Abweichungen bei der Zuordnung von Integritätsbewertungen zu verringern.

Discussion

Postnatale neugeborene Mäusen haben sehr begrenzte Mobilität und nicht, um sich gleich danach auf den Rücken gesetzt wird, auch wenn unangefochten. Von DOL 7, im Alter von Mäusen, die in diesem Modell in Frage gestellt eine Palette von Bewegung – von Rechte-Mobile bis hin zu FTR-Mobile verzeichneten unangefochten Mäuse mit einem wichtigen Unterschied, nämlich, dass eine unangefochtene Maus in diesem Alter nicht FTR-lethargisch Verhalten angezeigt. Nur Mäuse mit Biofilm Sepsis in Frage gestellt wurden, werden beobachtet FTR-träge; Diese Antwort kann eine Markierung der Schwere der Erkrankung. Der Cut-off von einem 90°-Winkel von horizontal für Hüftbewegung aufmerksam sein kann für die konsistente und genaue Zuordnung der lethargisch oder mobile Hüftbewegung bei Mäusen. Der Zeitrahmen von 4 s zu sehen, ob eine Maus kann sich rechts wurde ausgewählt, weil unangefochten Mäuse konsequent selbst innerhalb dieses Zeitrahmens rechts konnten. Wiederholte Messung der gleichen Maus konnte vermieden werden, während die Zeit, um sich richtig und die Messung der hip Mobilität beschränkte sich auf 4 s, um zu vermeiden, übermäßig anstrengend der Maus beeinflussen könnten sonst seine Fähigkeit zu essen und Wärme erhalten und könnte Auswirkungen auf seine Prognose, besser zu werden. Aufrichtenden selbst aus der linken und der rechten Seite beobachtet, und desto höher die Punktzahl wurde verwendet, um festzustellen, ob die Maus an eine humane Endpunkt war, weil einige Mäuse gefunden wurden, auf einer Seite anzuzeigenden FTR-Nonmobile noch eine höhere Mobilität auf der anderen Seite und b e schließlich wiederherstellen.

Das scoring-System verwendet, um Maus Gesundheit bewerten stützte sich auf die Anwendung des kategorischen Abschaltungen, was ein Spektrum der Bewegung ist und daher anfällig für individuelle Neigung sein könnte. Personal war zusammen ausgebildet, um sicherzustellen, dass jede Person die Mäuse erzielte das gleiche; jedoch bleibt wahrscheinlich ein Maß an Subjektivität zu Variation. Die Konsistenz des scoring wurde ausgewertet, indem er sieben Forscher, die nicht zuvor die Neugeborenen Maus Überwachung durchgeführt hatte lernen die Anforderungen in diesem Protokoll und Video dann unabhängig Verhaltensweisen zuordnen und bestimmen humane Endpunkt. Eine 97 % ige Genauigkeit beobachtet mit scoring auf 60 herausgefordert Mäuse, was darauf hindeutet, dass individuelle Voreingenommenheit keine wesentliche Rolle bei der behavioralen Aufgaben dieses Modells spielt durchgeführt. Die vorgestellte Verhaltens Überwachungsprotokoll basiert auf Beobachtungen von Tieren auf DOL 7 in Frage gestellt, doch Mäuse jünger als 6 Tage in einem unangefochten gesunden Zustand können nicht konsequent rechts selbst. So konnte die beschriebene humane Endpoint-Kriterien nicht direkt an jüngeren Mäusen angewendet werden. Wenn jüngere Mäuse in diesem experimentellen Modell verwendet werden oder wenn eine andere Herausforderung-Modell mit verschiedenen Krankheiten Kinetik angewendet wird, müssen geeignete humane Endpoint-Kriterien entwickelt und pilotiert um die Euthanasie von Mäusen zu vermeiden, das würde sonst, schließlich werden, wiederhergestellt werden. Das scoring-System zeigt eine robuste Methode zur Verbesserung der humane Endpoint-Klassifizierung, die mit der Prüfung und Bestätigung, potenziell zu anderen Modellen angewendet werden könnte.

Jede Zubereitung cecal Gülle oder die Verwendung von eine neue Maus-Belastung erforderlich, die Retitration der cecal Gülle Dosis zu verabreichen, um eine ähnliche tödliche Dosis zu erreichen. Jede Zubereitung wurde standardisiert durch das Auslesen von Interesse, nämlich überleben, anstatt die gleiche Keimzahl. Jede cecal Gülle Zubereitung tragfähige Bakterienkonzentration variiert leicht, möglicherweise aufgrund von Unterschieden in den Spender Kommensalen Bakterien oder aufgrund von Abweichungen in der Gewichtsklasse verließ die Zelle Sieb von den cecal Gülle Lager Postfiltration. Während der Titration cecal Gülle die ersten beiden Würfe wurden in zwei Gruppen aufgeteilt und jeweils die Hälfte des Wurfes wurden mit einem der zwei Dosen angefochten, so dass jeder der Dosen in zwei Würfen geprüft werden würde. Wenn die resultierende Überlebensrate nicht das erforderliche Niveau übereinstimmen, dann die Herausforderung-Dosis wurde entweder erhöht oder verringert durch 5 % – 10 % und das Experiment wiederholt. Mehrere Würfe wurden verwendet, um den Wurf zu Wurf Unterschiede ausmachen, das könnte dazu führen, dass Widerstand oder erhöhte Anfälligkeit zur Sepsis über einen Wurf. Es war wichtig, genau den cecal Gülle bestand mit jeder neuen Vorbereitung um sicherzustellen, dass die neue Titration cecal Gülle vergleichbar mit früheren cecal Gülle Vorbereitungen Titer. Perioden der überschüssige Lärm und Vibrationen, speziell während der Verdichtung von Asphalt und den Bau von einem nahe gelegenen Gebäude und Straße, wurden beobachtet, um Stress in der Dämme zu erhöhen. Dies korreliert mit erhöhten Raten von Kannibalisierung und beeinflusst die Sterblichkeit der überleben Experimente, sogar beeinflussen unangefochten Mäuse, die angibt, dass es unwesentliche Auswirkungen auf das neonatale überleben, die auch kontrolliert werden müssen.

Vorherige Methoden für cecal Gülle Stoffaufbereitung enthalten entweder die Verwendung von frischen cecal Gülle oder die Vorbereitung von gefrorenen cecal Gülle, mit einer Vielzahl von Methoden, einschließlich der Lagerung in Glycerin, die unweigerlich während der Challenge übertragen werden würde. Während die Verwendung von frischen cecal Gülle den Vorteil bietet, dass eine bakterielle Zusammensetzung am nächsten zum ursprünglichen cecal Inhalt, besteht die Gefahr von Abweichungen zwischen den einzelnen Spender Mäuse aufgrund der Variation von Kommensalen Bakterien. Während dies mithilfe cecal Spender vom selben Hersteller mit minimalem Zeitaufwand zwischen Ankunft und das Fortschreiten des Experiments minimiert wurde, könnte dies ein kostspielig Option für einige Labore und präsentiert einen anderen Zeitpunkt logistische Herausforderung mit Alter abgestimmt Mäuse verfügbar, wenn eine cecal Gülle zu Beginn experimentieren bei neugeborenen Mäusen, die 7 Tage alt waren. Eine alternative Methode zur Verwendung von frischen cecal Gülle wurde verwendet, wo mehrere Erwachsenen Spendern cecal Inhalt wurden zusammengefasst, Nukleinsäuretablette in D5W, bei-80 ° C ohne Glycerin, eingefroren und wieder aufgetaut einen aliquoten zu einem Zeitpunkt für Experimente. Die Nutzung von Erwachsenen Spender cecal Gülle, neonatale Sepsis zu studieren könnte potenziell transfer Arten von Bakterien in die cecal Gülle, die Neugeborene Maus nicht ausgesetzt worden ist, aber es ist eine Strategie, die für das Studium der Sepsis in den neugeborenen Mäusen ermöglicht und wurde zur Neugeborenen Maus Biologie in den letzten13,14,15zu studieren. Cecal Gülle wurde verdünnt in D5W Ernährung anzubieten die Bakterien ermöglichte die Einrichtung einer aktiven Infektion sobald die Bakterien injiziert wurden, und wurde getan, um die Verfügbarkeit von Nährstoffen in die Bauchhöhle während nekrotisierende imitieren Enterokolitis. Glycerin wurde nicht als Stabilisierungsmittel in eisigen Bakterien wegen der potenziellen negativen Nebenwirkungen, die sich aus Glycerin Injektion allein. Wenn Glycerin in der cecal Gülle Vorbereitung einbezogen worden, dann der potenzielle Schaden, dass Glycerin allein könnte auslösen würde müssen getestet werden durch die Einbeziehung einer nur Glycerin (fehlende cecal Gülle) Injektion bei Mäusen, denen erhöht hätten Maus Nutzung. Die Bakterien Lebensfähigkeit der cecal Gülle Bestände wurde nach dem Einfrieren des cecal Gülle Bestand ohne Glycerin getestet und erwies sich konstant, bei unveränderter Bakterien-Konzentration im separaten Aliquote die gleiche cecal Gülle-Vorbereitung bei-80 ° C über eine 6 gelagert werden Monats-Zeitraum. Dies deutet darauf hin, dass die Lagerung ohne Glycerin bei der Bereitstellung von einem konsequenten biologischen Ergebnis machbar ist. Die Verwendung von einer Masse vorbereitet gefroren cecal Gülle bestand erlaubt auch für den Einsatz von Mäusen gezüchtet im eigenen Haus, Kostensenkung und Verwendung von männlichen Mäusen, die sonst aus der Zucht überschüssige, wodurch Maus Verschwendung.

Die Identifikation des gescheiterten Herausforderungen bei Mäusen war wichtig, zu vermeiden, dem System zusätzliche Rauschen hinzufügen. Nach Durchlaufen einer intraperitonealen Injektion von cecal Gülle, wurden die Mäuse für das Vorhandensein einer Beule unter der Haut beobachtet, die eine fehlerhafte Injektion angegeben, die tatsächlich subkutane war. Mäuse für Lecks an der Injektionsstelle beobachtet wurden, sofort nach Entfernung der Nadel und nach der es ihnen ermöglicht, einen Schritt nach der Injektion, da Mäuse manchmal würde auslaufen (selten) erst nach dem Umzug der Extremität der Injektionsstelle durch einen Schritt. Das Vorhandensein einer Ausbuchtung oder Leck nach der Injektion führte die Maus aus der Analyse entfernt. Immerhin könnte diese in ein anderes Ergebnis aufgrund der falschen cecal Gülle injiziert, da eine Differenz von 5 % in Herausforderung Dosis beobachtet hat, um nachfolgende Überleben beeinflussen.

Cecal Gülle Herausforderung Experimenten oft erforderlichen unterschiedlichen Ziel letalen Dosen mit unterschiedlichen Dosen Gewicht angepasst. Aus diesem Grund können die Einspritzmengen von weniger als 20 µL bis 100 µL reichen. Die verhältnismäßig experimentellen Fehler in Verbindung mit Toten Nadel Volumenänderungen auch zusammen mit das Injektionsvolumen, Erhöhung der Schwierigkeit um verschiedene Dosen direkt miteinander zu vergleichen. Mit der einfachen Änderung der Standardisierung des Injektionsvolumen wird diese Quelle der Varianz des Experiments entfernt.

Die Neugeborenen Maus Verhaltens monitoring-System in diesem Protokoll verwendeten ist das erste seiner Art. Forscher auf ethische forschen mit Neugeborenen Mäusen bedacht sind oft konfrontiert mit dem herausfordernden Mangel an Ressourcen, um das Wohlbefinden des Tieres in diesem Alter zu bewerten. Die vorgestellte intuitive und konsequente monitoring-System beginnt diese Wissenslücke anzusprechen. Wichtig ist, diese Beweise orientierter Ansatz nicht nur erhöht die Qualität der gewonnenen experimentellen Daten jedoch zur gleichen Zeit, reduziert auch das Leiden der Versuchstiere.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Besonderen Dank an Claire Harrison und der Animal Care Facility in British Columbia Kinder Krankenhaus Research Institute (BCCHR) für ihre Unterstützung in der tierische Arbeit, sowie Dr. Po-Yan Cheng für ihre Führung und Input auf tierische Überwachung und Wohlbefinden.

Materials

0.1 – 20 μL pipette tips VWR 732-0799
1.8 mL Microcentrifuge tube Costar 3621
100 – 1000 μL pipette tips VWR 732-0801
1 – 200 μL pipette tips VWR 732-0800
15 mL Centrifuge tube FroggaBio TB15-25
23G1 needles Becton Dickinson 305145 only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam
28G 0.5 mL Insulin syringe BD 329461
2 mL Cryogenic vial Corning 430488
50 mL Centrifuge tube Fisher scientific 14-432-22
5 mL pipette Costar 4487
6 – 10 week old C57BL/6J adult mice Jackson Laboratories 664
7 + day old C57BL/6J neonatal mice Bred in house n.a
70 μm Cell strainer Falcon 352350
Defibrinated Sheep's Blood Dalynn HS30-500
Dextrose 5% Water (D5W) Baxter JB0080
Dissecting forceps VWR  82027-386
Dissecting Scissors, Sharp Tip VWR  82027-592
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip VWR 82027-594
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) Fisherbrand HC11001GL diluted to 70% with double distilled water
Ethanol-proof marker; Lab marker VWR 52877-310
EZ Anesthesia Vaporizer EZ Anesthesia EZ-155
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) Braintree Scientific GER 5287-120V
Isoflurane Fresenius Kabi CP0406V2
Micro Spatula Chemglass CG-1983-12
Pipette-Aid Drummond 4-000-100
Rainin Classic Pipette PR-1000 Rainin 17008653
Rainin Classic Pipette PR-20 Rainin 17008650
Rainin Classic Pipette PR-200 Rainin 17008652
Scale Sartorius BL 150 S
Specimen forceps VWR 82027-440 / 82027-442
Square 1000 mL Storage Bottle Corning 431433
Styrofoam board Any n.a
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber Euthanex EZ-178
Tryptic Soy Agar Sigma-Aldrich 22091-2.5KG
VX-200 Lab Vortex Mixer Labnet International S0200
weigh paper Fisherbrand 09-898-12B
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Brook, B., Amenyogbe, N., Ben-Othman, R., Cai, B., Harbeson, D., Francis, F., Liu, A. C., Varankovich, N., Wynn, J., Kollmann, T. R. A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis. J. Vis. Exp. (143), e58574, doi:10.3791/58574 (2019).
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