JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Yenidoğan Polymicrobial Sepsis için kontrollü fare modeli

Published: January 27, 2019
doi:
10.3791/58574
, , , , , , , , ,
1Department of Experimental Medicine,University of British Columbia, 2Department of Pediatrics, Division of Infectious Diseases,University of British Columbia, 3Department of Pediatrics, College of Medicine,University of Florida, 4Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine,University of Florida

Summary

Bu iletişim kuralı kurmak ve 7 günlük eski farelerde neonatal sepsis değerlendirmek için gerekli adımları sağlar.

Abstract

Neonatal sepsis küresel bir yük kalır. Preklinik manken ekran etkili profilaktik veya tedavi müdahaleler için gereklidir. Yenidoğan fare polymicrobial sepsis cecal Bulamaç intraperitoneally hayat 7 fare gün içine enjekte ve onları aşağıdaki hafta için izleme bağlı olmak. Burada sunulan bu neonatal sepsis model uygulanması için gerekli detaylı adım vardır. Bu ağırlık ve çöp ayarlanmış doz, anahat izleme zamanlama ve gözlemlenen sağlık Kategoriler insana ilişkin bitiş noktaları tanımlamak için kullanılan bir tanımını sulandrarak homojen cecal Bulamaç hisse senedi, yapım içerir. Birçok çöp içine yönetim zamanla, bağışçılar arasında varyasyon azaltılması ve potansiyel olarak toksik gliserol kullanımını engelleme için havuza alınan bağış homojen cecal Bulamaç stoktan nesil sağlar. Hayatta kalma sonucu beklentisiyle ve daha sonra insana ilişkin son nokta için bir önceki kimlik izin ölüme ilerleme fareler tanımlanması için kullanılan izleme stratejisi sağlar. İki temel davranış özellikleri sağlık puanları, yani, yetenek yenidoğan farelerin kendilerini onların sırt ve hareketlilik düzeylerini yerleştirildiğinde sağ tanımlamak için kullanılır. Bir pilot çalışma doğruluğunu onaylamak için gerçekleştirilen sürece bu kriterleri adresi insana ilişkin bitiş noktaları, farelerde neonatal hastalık diğer çalışmalarda potansiyel olarak uygulanabilir. Sonuç olarak, bu yaklaşım hayvan refahı meydan hayvanlar için erken insana ilişkin bitiş noktalarını tanımlamak için kullanılan değerlendirmek için kaynakları sağlarken modeli yenidoğan Sepsisinde farelerde, standart bir yöntem sağlar.

Introduction

Sepsis, insan yeni doğan bulaşıcı ölüm1önde gelen nedenidir. Yenidoğan Sepsisinde kötü anlaşılmaktadır çünkü az bir ilerleme her iki hastalık sırasında erken risk altındaki yenidoğan tanımlaması ve etkili tedaviler veya prophylaxes geliştirme yapılmıştır. Bu süreci ve test olası müdahaleler daha iyi anlamak için sepsis hayvan modelleri kullanımını gerektirir. Ayrıca, Yetişkin kemirgenler farklı sepsis, aynı öldürücü doz (LD) elde etmek için yönetmek için bakteri sayısı istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar ve yenidoğan2ile karşılaştırıldığında elde edilen ana bilgisayar yanıt farklılıkları ile yanıt. Böylece, neonatal sepsis ventilasyon içinde incelenecektir vardır. Birkaç yetişkin sepsis modelleri sepsis araştırmada kullanılmıştır. Bunlar belirli organizmalarla yetişkin insan sepsis veya cecal tüp ligasyonu ve ponksiyon (CLP) karıştığı bir intravenöz challenge içerir. CLP burada çekum cerrahi olarak izole, tane ve bağırsak içeriği kaçağı periton izin vermek için delinmiş bir endojen meydan okuma sonunda sistemik dağıtımı mikroplar ve onların ürünleri3lider modelidir. Ancak, CLP kurmak için gerekli cerrahi müdahale için yeni doğmuş hayvanlar öldürücü. Bu nedenle, farklı bir yöntem neonatal sepsis ikna etmek için CLP polymicrobial meydan taklit etmek gereklidir. Yenidoğan polymicrobial sepsis için cecal Bulamaç modeli mademki hayvanlar cecal içeriğini hasat, steril dekstroz sudaki (D5W) % 5 askıya ve intraperitoneally yeni doğan fareler2enjekte bu gereksinimi karşılamak için geliştirilmiştir. Bu yana, sepsis yeni doğan ve yetişkin hayvanlarda eğitim için giderek daha popüler bir model haline gelmiştir ve hastalığın süreci4,5,6,7 mekanik anlayışlar önemli ölçüde ilerlemiştir ,8,9,10,11,12,13,14,15.

Bu model artan kullanımı ve doğrudan sonuçları yayınlar arasında karşılaştırmak için araştırmacılar arzunun göz önüne alındığında, teknik özellikleri de açıklanmıştır ve standart çalışmalar arasında olmak için gerek yoktur. Standardizasyon model, üç yönden Yani, i) cecal Bulamaç stok, II) hazırlanması meydan aliquots için deneysel hayvan içine enjeksiyon ve III) insana ilişkin bitiş noktası tanımını hazırlanması sayede hayvanlar için geçerlidir nonsurvivors meydan deneylerde olarak kabul edilir. Özellikle, cecal Bulamaç hisse senedi hazırlamak için yöntemleri kez orijinal araştırma modeli2tanıtımı için başvurulur. Bu model kısa bir özetini cecal içindekiler–dan yetişkin fareler hasat, 80 mg/mL konsantrasyonu steril D5W askıya ve içinde 2 h deneysel hayvan enjekte için kullanılan var. Bu orijinal modeli ile onların anılan sıraya göre araştırma tesislerinde cecal içeriği hasat öncesinde en az 2 hafta için muhafaza aynı satıcı konumdan fareler aynı yaştaki kullanılır. Şirket içinde yetişmiş fareler, kullanımı düzenli satıcı teslimat ve aşırı fareler, cinsiyet ve yaş, daha geniş bir aralığı için izin maliyeti azaltmak, ancak aynı zamanda önemli ölçüde donör donör değişkenlik arttı. Bu sayede birden fazla fareler cecal içeriğinden birlikte bölünmemeli ve saklı-80 ° C13büyük bir hisse senedi hazırlamak için havuza alternatif bir teknik geliştirme motive. Bu alternatif yöntem birden çok grupları14,15tarafından uyarlanmıştır. Ancak, bazı teknik varyasyonları, kullanılan depolama ortamı (% 10 veya % 15 gliserol veya D5W tek başına) ve hem de filtrasyon partikül kaldırmak için strateji bu adaptasyon sonuçlandı (860 µm ve sonra 190 µm çok kademeli filtrasyon filtre veya birey Filtrations 100 µm veya 70 µm filtreleri yoluyla)13,14,15. %25 – %50 gliserol enjeksiyonları böbrek yaralanma16,17,18,19kemirgen bir model olarak kullanılan verilen bu gliserol yalnız enjeksiyon potansiyel olarak, zarar verebilecek, 20. Gliserol istenmeyen yan etkileri önlemek için bu çalışmada fareler için cecal Bulamaç hisse senedi hazırlık D5W içinde gliserol dondurulur ve depolama-80 ° C’de bakteriyel canlılık testleri yapılır. Bu çalışmada kullanılan filtrasyon doğrudan diğer filtrasyon stratejileri için listelenen kıyaslanamaz bir 70 µm filtresi ile tek seferde stratejisidir.

Enjekte cecal Bulamaç ağırlık-düzeltilir öldürücü dozda tesis tesis değişebilir ve bireysel gruplar için istenen lethality için dışarı titered olmalıdır. Farklı meydan doz ile eşlik eden meydan okuma birimleri elzem değiştirin. Ancak, bu metodolojik ayrıntı daha önce bildirilmemiştir. Ayrıca, mayi enjeksiyon gibi standart prosedürler için stratejiler nadiren edebiyat içinde üzerinde özenli, ama yeni doğmuş fare enjekte edildiğinde sızıntı ve onların final sonuçları etkisi olup olmadığını bireysel teknikleri etkileyebilir.

Hayvan refahı, insana ilişkin bitiş noktası, bir tanım da dahil olmak üzere bu modelin enfeksiyon ve kemirgenler21iltihabı, herhangi bir modeli merkezi bir yönüdür. 1998 yılında Kanada Konseyi hayvan bakım (CCAC) yayınlanan insana ilişkin son nokta seçimi için kapsamlı yönergeler “herhangi bir gerçek ya da potansiyel ağrı, acı veya rahatsızlık veya simge durumuna küçültülmemiş en erken seçim yaparak ortadan kalkar gibi insana ilişkin bitiş noktası tanımlama Son nokta bu araştırma bilimsel hedefleri ile uyumlu “22. Diğerleri de insana ilişkin bitiş noktaları oluşturulmalıdır dikkat bilimsel gerekçe yerine öznel bir hayvanın devlet tek başına21yorumlanması göre. İçin kaynaklarının zenginliği ise klinik, davranışsal ve vücut-Koşul ölçütlerini inflamasyon ve enfeksiyon bağlamında bile insana ilişkin son nokta için oturum tabanlı özellikle21,23,24, hiçbiri-in bunlar , insana ilişkin bitiş noktası22, CCAC yönergeleri de dahil olmak üzere söz yeni doğan fareler. Böylece, objektif ve bilimsel olarak haklı insana ilişkin bitiş noktaları yetişkin için yaygın olarak kullanılan kilo kaybı gibi ölçütler arasında sınırlı davranışsal yetenekleri ve delil yetersizliğinden verilen yeni doğan hayvanlar için kurmak çok daha zordur fareler. Şu anda, tüm model2kullanılmaya geri orijinal el yazması için başvuru cecal Bulamaç edebiyat 5 için 12 gün-çocuk yenidoğan fareler için kullanılan insana ilişkin son nokta için ölçüt. Bu orijinal yazıda, yeni doğan hayvanlar için insana ilişkin bitiş noktası tanımını iki kriterlere göre; Yani, bir fare yuvası (saçılma) dışında konumunu ve süt noktalar eksikliği ölüm saat içinde neden için görülmüştür. İnsancıl bir bitiş noktası atanmasında bozan süt noktalar hasta hayvanlara hayat (DOL) 14 güne kadar izlenir iken fare suşları yaygın olarak istihdam C57BL/6J zorlanma gibi koyu kürk ile hayat, ilk hafta sonra görmek zor hale meselesi. Ayrıca, ölü hayvanlar bu ölçütleri uygulanırken postchallenge bulunabilir (kendi gözlem; yayınlanmamış); Böylece, daha sıkı bir insana ilişkin bitiş noktası tanımını deneysel hayvan acı hafifletmek ve nerede sonucu doğru bir şekilde daha önce ayırt edilebilir durumlarda ölüm önlemek gereklidir.

Cecal Bulamaç modeli her üç metodolojik açıdan bir standart çalışma prosedürü cecal Bulamaç stok hazırlanması ayrıntılı sunulmaktadır, deneysel hayvan enjekte bir yöntem bu doz arasında enjeksiyon birim sabit tutar ve sızıntı riski ve davranışsal modelleme sistemini temel alan 7 için 12-günlük eski fareler için insana ilişkin bitiş noktası tanımını azaltır. Fare sağlık puanları’den fazla 240 deneysel hayvan davranış bilgiler toplanır ve insana ilişkin bitiş noktası kanıt temelli bir tanımını gösteren son hayatta kalma sonucu tarafından gruplandırılmış. Deneysel hayvan acı biyolojik olarak önemli sağkalım sonuçları anahtar değişkenler gözlemleyerek anlaşılmaktadır olabilir süre en erken zamanda noktada can çekişen yenidoğan fareler tanımlayarak azalır. Cecal Bulamaç hazırlık ve neonatal fare davranışları görsel temsilini sepsis ya da yeni doğan meydan modeli hayvanlar eğitim herhangi bir grup için mükemmel bir kaynak olarak görev yapacak.

Protocol

Bu iletişim kuralı tüm deneyler protokol numarası A17-0110 altında British Columbia Üniversitesi hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış olması. 1. aracı sterilizasyon Bir biyolojik güvenlik kabini (BSC), açmak ve sıcak boncuk ısıtıcı ile 250 ° C arasında kullanmadan önce en az 30 dakika onceden. % 70 etanol araçlarında daldırma. Araçlar en az 1 dk önceden ısıtılmış sıcak boncuk ısıtıcı içine daldırın.Not: Araçlar kolları sıcak alacak ve üzerinde 1,5 dk sıcak boncuk Sterilizatör bırakılırsa yanabilir. Bir mat kağıt havlu bu sterilize etmek için % 70 etanol ile sprey. Diğer batık araçları nonsteril kolları aracına sterilize parçası dokunmadan sıcak boncuk ısıtıcı araçları kaldırmak ve etanol püskürtülür kağıt havlu üzerine koyun. 30 için bekle s diseksiyon için kullanmadan önce soğumasını araçları için 2 dakika. 2. cecal Bulamaç hazırlık 15 mL santrifüj tüpleri (euthanized her beş fareler için bir tüp) preweigh. Cecal Bulamaç bağış yerel hayvan bakımı esaslarına göre ötenazi veya aşağıdaki iletişim kuralı kullanın.Not: 6 ve 12 hafta arasında 40 C57BL/6J fareler kadar eski cecal Bulamaç hazırlık için en çok beş fareler teker teker ötenazi ile kullanıldı. Fareler ötenazi odasına aktarmak ve isoflurane anestezi makinesi %5 oksijen perfüzyon ile ayarlayın. Fare taşımak ve anestezi cerrahi uçak girerek onları görmek için yetenek kaybı gözlemlemek ve son olarak, nefes izlemek. Bir fare ötenazi odasından kaldırın, pençe çimdik ve herhangi bir bacak geri çekilmesi veya inhalasyon gözlemlemek. Herhangi mevcut olduğunda, fareyi ötenazi odasına dönmek; Aksi halde, devam edin. Ölümcül fareler tarafından keskin servikal çıkığı ötenazi. Çekum diseksiyon, bir BSC (bkz: 1) presterilized ve soğutmalı araçlar kullanarak gerçekleştirin. Fareyi fare onun karın olan kadar 23 G iğneler kullanılarak bir haddelenmiş polistren köpük kuruluna bacaklar pin. Güvenli ve daha sonra karın % 70 etanol ile sprey. Steril forseps ve makas kullanarak, deri yoluyla kesilmiş, makas ve kesme açık dikdörtgen bir kasık bölgesinden için göğüs kemiği ile periton astar ve sol tarafı deriden sağ tarafında gevşetin. Herhangi bir kürk Karın zarını kaldırın. Bir çift olanlar temas kullandıysanız araçları deri değiştirme cilt için olduğu gibi dikdörtgen bir açılış yapmak periton ile kesmek için steril araçları geçin. Sağa doğru vücut sol çalışmalıdır çekum tanımlayın. Çekum dalları bağırsaklarını üzerinden tanımlamak ve bağırsak uzak çekum kesmek için bağ dokusu bozabilir. Çekum kağıt tartma steril bir sayfaya yerleştirin.Not: kağıt ağırlığındaki ya her iki tarafı ve gideriş o kuru üzerinde % 70 etanol ile püskürtme veya UV ışınlama sterilize. Alternatif olarak, çekum steril Petri tabağa kesmiştim. Cecal içerik ekstrüzyon Bir lisans her iki ucunda da çekum ile kesmek için steril araçlarını kullanın. Çekum ortasına steril forseps ile tutun ve hafifçe itmek dışarı kesme cecal içeriği sona erer, bir hareket haddeleme ve epitel evrenimizi kazıma bir hareket kaçınarak kullanarak bir düz steril metal spatula kullanın. İçeriği toplamak ve bir preweighed 15 mL santrifüj tüpüne koyun. Cecal içindekiler–dan en fazla beş fareler aynı tüpüne havuz. Tüm içeriği eklediğinizde tüp yeniden tartın.Not: 300 mg ortalama bekliyoruz ve fare başına cecal Bulamaç 390 mg için fare; başına resuspension için 1.8-2.4 mL D5W gerektiren Bu nedenle, bu adımı sırasında beşten fazla fare kullanarak 15 mL santrifüj tüpü yavaşça sonuçlanabilir. Araçlar temiz bir etanol püskürtülür kağıt havlu ile silin ve onları adımları 1.2-1.6 tekrar ederek resterilize. Cecal Bulamaç filtrasyon Cecal içeriği ile dolu santrifüj tüpü tartmak ve denklem aşağıda olduğu gibi mililitre başına miligram istenen stok konsantrasyon cecal içeriği ağırlığına bölünerek cecal içindekilere eklemek D5W tutarını hesaplar. Bir lisans cecal içeriği içeren 15 mL santrifüj tüpü buz gibi D5W gerekli miktarda ekleyin. Girdap 15 mL tüp dikey ve yatay olarak daha–dan 1-3 mm çapında partikül için 30 s. onay için santrifüj kapasitesi ve varsa, tüm büyük partikül gözle görülür kayboldu kadar vortexing devam edin. Steril bir 70 µm hücre süzgeç buza yerleştirilir bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin. Resuspended cecal Bulamaç 4 mL hücre süzgeç içine ve sonra koleksiyon Tube pipet. Partikül yukarı ve aşağı 2 x-3 x pipetting tarafından resuspend. Filtre uygulanan hiçbir daha fazla damlacıkları olana içeriği pipet ucu ile karıştırarak filtreleme hızını artırmak için baloncuklar yavaşça A’ya.Not: karıştırma zaman, orada-ebilmek var olmak partikül 5 mL pipet takmak için yeterince büyük. Bu durumda, vortexing 2.5.3. adımdaki yineleyin ve çözüm hala ayrı kesilmez, pipet partikül santrifüj tüpü duvara karşı basın için kullanın. Filtrate hacmi buz kutusunda buz düzeyi aşarsa hücre süzgeçler her tüp cecal bulamaç ve havuzu arasında değişen 2.5.4, tüm içeriği buzda muhafaza aynı 50 mL santrifüj toplama tüp veya ikinci bir 50 mL santrifüj tüpü adımları yineleyin. Aliquot cecal bulamaç. Varsa, birden fazla 50 mL cecal Bulamaç filtrate tüpler daha büyük bir steril kaba (örneğin, bir 1000 mL depolama şişe) 2.5.5. adımdaki birleştirin. O zaman, 15 s ve yer içine yeni bir 50 mL santrifüj tüpü 20 mL için girdap. Girdap 50 mL santrifüj tüpü için 5-10 s ve zaman içinde buharlaşma önlemek için bir lastik conta var üç 2 mL kriyojenik tüpleri içine aliquot 500 µL mevcuttur cecal Bulamaç hisse senedi. Hemen ana stok ve bölünmemeli kriyojenik flakon buza koyun. Tüm cecal Bulamaç olmuş bölünmemeli, 2.6.1 ve 2.6.2 tamamlayana dek vortexing sonra her üç kriyojenik şişeleri herhangi bir partikül yerleşme engellemek ve homojen bir karışım korumak için ana stok. Cecal Bulamaç aliquots-80 ° C’de dondurmakNot: her yetişkin fare üzerinden 500 µL, 3-4 hisse senedi şişeleri arasında bekliyoruz. Her hisse senedi şişe yeterince kabaca challenge bir çöp DOL 7 sekiz farelerin olmalıdır. 3. sepsis challenge 7 bayat yenidoğan farelerin Ayırmak, tanımlamak ve neonatal fareler tartın. Bir BSC yenidoğan fareler fare baraj uzak tutmak için ve baraj için stresi azaltmak için yeni bir kafes aktarın. Kaldırmak ve eldiven eldiven için kafes’ın kokusu aktarmak ile iç içe geçmiş malzemenin bir parçası rub. Sonra iç içe geçmiş malzeme daha küçük bir yuva kalıp ve baraj olmadan yeni bir kafes içine yerleştirin. Yenidoğan fareler yeni kafes içinde iç içe geçmiş malzeme aktarın. Yeni kafeste bir ikinci, boş yuva yapmak için daha fazla malzeme iç içe aktarın. Kapatın ve baraj herhangi yenidoğan fareler’ın sıkıntının işitme vurguladı değil Barajı’nın kafes hood kaldırmak. Zaman içinde belgili tanımlık çöp içinde bireysel yenidoğan fareler izlemek için en çok beş nokta önünde veya her 12-24 h yeniden uygulanması gerektiği gibi kuyruk, ters işaretlemek için bir etanol-kanıt işareti kullanın. Bu meydan olacak, her ikincil içine yerleştirerek ağırlığında sonra iç içe ve fareler için bu işlemi yineleyin her fare tartın. Tüm çöp aliquot cecal Bulamaç meydan hazırlamadan önce baraj için dönmek. Ağırlık-düzeltilir bireysel dozlarda cecal bulamaç ve gerekli seyreltme D5W ile ayrı ayrı her çöp için bu adımı tamamlamak, aşağıdaki hesaplamaları kullanarak veya sağlanan çalışma kullanarak hesaplamak ( Tamamlayıcı dosyasınabakın). Fare (c) gram başına cecal Bulamaç mg istenen meydan doz tarafından gram (b) farenin ağırlığını çarparak her fare yönetilecek cecal Bulamaç (bir) miligram hesaplayın. Su katılmamış cecal Bulamaç hisse senedi başına microliters (d) fare fare adım 3.2.1 (bir) başına gerekli cecal Bulamaç mg bölerek gerekli bireysel birim hisse senedi cecal Bulamaç konsantrasyon tarafından cecal Bulamaç mg 160 hesaplamak D5W mililitre başına (e) ve microliters için mililitre dönüştürmek için mililitre başına 1.000 µL tarafından çarparak. Ortalama cecal Bulamaç stok hacmi fare (g) a çöp-in n fare fareler (n) numarasına göre bölünmüş, fare başına cecal Bulamaç stok (d) hacmi toplayarak gerekli. Ortalama seyreltme faktörü cecal Bulamaç hisse senedi (h) için Ortalama enjeksiyon hacmi (100 µL) bölerek cecal Bulamaç gerekli fare (g) ortalama hisse senedi hacmen hesaplayın. Microliters (j) her fare belirli enjeksiyon hacmi ortalama seyreltme faktörü (h) tarafından gerekli stok cecal Bulamaç (d) hacmi her fare çarparak hesaplamak ve sonra en yakın on yuvarlama (eşleştirmek için 10 µL artımlar halinde enjeksiyon şırınga). D5W cecal Bulamaç hisse senedi (k) sulandırmak için gerekli ortalama hacmi ortalama cecal Bulamaç hisse senedi (g) ortalama enjeksiyon birimden (100 µL) çıkararak hesaplar. Ortalama hisse senedi cecal Bulamaç başına microliters (g) fare bu çöp (n) farelerde sayısıyla çarparak ve ilave oluşturmak için 1.4 tarafından çarparak tarafından microliters (l) cecal Bulamaç stokunun toplam miktarı hesaplamak. D5W, toplam miktarı cecal Bulamaç hisse senedi D5W ortalama gerekli hacmi çarparak sulandırmak için gerekli microliters (m), (k) fare (n) ve ilave oluşturmak için 1.4 tarafından teksir makinesi sayısına göre. Meydan aliquot hisse senedi cecal Bulamaç (l 3.2.7. adımdaki) gerekli miktarı hesaplama sonra hazırlayın. Bir lisans cecal Bulamaç hisse senedi şişeleri içeriğini karıştırmak için pipetting oda sıcaklığında gerekli sayıda çözülme. Hayır daha görünür olduğunda buz kristalleri çözdürülen cecal Bulamaç sunmak, steril 1,8 mL microcentrifuge tüp cecal Bulamaç stok (l 3.2.7. adımdaki) hesaplanan miktarı transfer. Gerekli konsantrasyonu için hesaplanan adım 3.2.8 (m) olarak buz gibi D5W ekleyerek sulandırmak. Meydan aliquot buzda saklayın. Şırınga yüklemeden önce microcentrifuge tüp flicking tarafından mix 20 x, 3 x çizim ve 500 cc 28 G ½ inç insülin şırınga ile 300-500 µL cecal Bulamaç, kovma ardından. Seyreltilmiş cecal Bulamaç kabaca 150 µL kadar aynı şırınga çizin. Kabarcıklar pistonu gelen çıkarmak, geri biraz şırıngayı çizmek ve baloncuklar kovmak için şırınga fiske. Aşırı cecal Bulamaç için adım 3.2.5 (j), bireysel farelerde şırıngada yüklü hesaplanan şekilde cecal Bulamaç için bir fare, doğru miktarda kadar geri microcentrifuge tüpüne dağıtmak. İntraperitoneally ilgili yerel hayvan bakımı kurum kurallarına göre cecal Bulamaç enjekte veya aşağıda özetlenen adımları kullanın. Bir BSC yenidoğan fareler baraj 3.1. adımda açıklandığı gibi ayrı. Scruff başparmak ve işaret parmağı kullanarak fare ile boyun arkası. Orta ve yüzük parmakları veya yüzük ve serçe parmak önündeki sırtına fare kuyruk güvenli. Sızıntıları en aza indirmek için böylece aşağı dönük yenidoğan fare eğilme ve yukarıya, bacak ve sığ ve derialtı iğne tutmak genital arasında karşı karşıya iğne iğne eğimi yerleştirin. İğne için 1 cm eklediğinizde, aşağı tuşuna basın ve karın zarını ponksiyon iğnesi hissediyorum iletmek. Yavaş yavaş yanal hareketleri fare organlara zarar verebilir gibi iğne ucu mümkün olduğunca sabit tutarak pistonu, bunalıma girmek. Dikkatle üzerinde iğne çekilme 5-10 lar, olduğu gibi orta parmak fare vücut gerginliği azaltmak için kaldırma sırasında rahatlatıcı dışarı aynı rotayı takip. Kaçakları kontrol etmek kapatmak, enjeksiyon yeri için zaman tanımak birkaç saniye sonra iğne kaldırılması için fareyi tutun ve herhangi bir sızıntı veya enjeksiyon yerinde hangi noktada Analize fare kullanılmamalıdır şişkin gözlemlemek.Not: enjeksiyon yerinde derinin şişkin başarısız mayi enjeksiyon, subkutan olmak injectant ile gösterir. Fareyi bir kağıt havlu getirin ve fareyi bir adım atmak izin. Fare için 5 hareketsiz ise s, sonra hafifçe kuyruk tuşuna basın. Fareyi kaldırıp ve cecal Bulamaç enjeksiyon yerinde herhangi bir sızıntı için kontrol edin. Bir sızıntı varsa, fare çözümleme dışı bırakmak ve fare ötenazi. 4. fare izleme Düzenli olarak bir insana ilişkin uç noktada gelen için denetlemek üzere fare izleyin. Fareyi herhangi bir enjeksiyon ile ilgili komplikasyonlar için 2 h postchallenge gözlemlemek. Fareler 12 h postchallenge sepsis ile ilgili hastalık ve insancıl bir uç noktada fareler tanımlaması için izlemek (bkz: adımlar 4.2-4.3 ölçütler için). Daha sonra her 4-6 h ilk 2 ne zaman yenidoğan fareler katılımsız günlere göre 8 h gecede, dışında izlemek. 2 gün postchallenge, günde 1 x-2 x izlemek. Hasta Eğer fare veya fare olan sistem durumu puanı azalır gözlenir, her 4-6 h izleme sıklığını artırın. Yenidoğan fareler izleme 3.1. adımda açıklandığı gibi yeni bir kafese malzeme yatak yenidoğan fareler içeren herhangi bir yordamı için transfer (aynı için nedenlerle de belirtildiği gibi orada). Bakım sırasında yuvadan sürükledi herhangi bir ventilasyon için dikkatle kontrol edin. Bakım sırasında çöp dışarı sürükledi herhangi bir fare fareler dağınık düşünülmemelidir. Üst kaldırırken yuva, yenidoğan fareler herhangi bir saçılma yuvadan uzak ya da kimliğinizi belirlemek veya iç içe geçmiş malzeme ama onların littermates, çöp hemşirelik süre uzakta sürüklenen fareler dışında uzak sıkışmış. Bir fare bulunursa adım 4.5 ölçütünde dağınık insana ilişkin son nokta için başvurun. Fareler’ın iyileştiren refleksleri ve hareketlilik ölçmek. Kağıt havlu üzerinde sırtında bir fare yerleştirin ve izlemek onun yetenek kendisini en fazla 4 içinde sağ s. Sırtında yerleştirildiğinde, fareyi ya sol ya da sağ tarafta, 4 s sayım başladığında olan düşecek.Not: “Haklar” gruba ayrılır için fareyi en az almak mümkün olması gerekir üç dört pençe 1 için kağıt havlu yastıkları s. Hala düşerse kendisi sağ edememek olarak gruplandırılır. Fare yapabilirsin kendisi değil, o zaman 8 için bekleyin hareketlilik seviyesini belirlemek için s. O kendisi sağ ve üst üste birden çok adımı gerçekleştirerek çevresi keşfetmek Eğer fare “hakları-Mobile” kategorize. O kendisi sağ ve çevresi keşfetmek için birkaç adım Eğer fare “Hakları-uyuşuk” kategorize. Bu grubu farelerde bir adım çekerken düşmek, kendi ayakları üzerinde titrek bakın ve adımlar arasındaki duraklatabilirsiniz. Eğer kendisi değil ama devamlı hareket etmez fare “hakları-Nonmobile” kategorize. Bitti, hala düşebilir ve herhangi bir adım 8 içinde almaz s, hakları-Nonmobile gruplandırılır. Kendisi fare doğru değil, kabiliyeti gözlenen kalça hareketi üzerinde göre kategorize.Not: belgili tanımlık sınıf başkanı tekrar önlemek veya bu skorlama sistemi ve insana ilişkin son nokta etkileyebilir çünkü fare onların back on geçirdiği zamanın uzunluğunu artırma, kendisini bazen 4 s can içinde sağa başarısız bir fare daha fazla zaman verilen yapmak öylesine eğer. Fare olarak kategorize “başaramamak-e doğru sağ (FTR)-Mobile” o kendisi sağ değiştiremiyor ve yatay açı 90 ° aşıyor kalça hareketi görüntüler. Bazı fareler kendilerini fazla 4 verilirse sağ s ama hala FTR kalça hareketi üzerinde temel hareketlilik puanları ile kategorize etmek gerekir. Kendisi sağ değiştiremiyor ve 90 ° açı yatay aşağıda kalça hareketi görüntüler fare “FTR-uyuşuk” kategorize. Fareyi “FTR-Nonmobile” kendisi sağ değiştiremiyor ve sallamak veya titreşimle ayağı vardır ama hiçbir kalça hareketi olarak kategorize. Bacaklarda genişletmek veya geri çek ama yapmak değil-si olmak yanal hareketi. Fare gözle görülür hasta olduğunu ve insana ilişkin bitiş noktası ulaşmıştır. 4.3 fareyi her iki kayıt, diğer tarafında arasındaki adımları yineleyin.Not: Ek dosya gözlemleri kaydetmek için bakın. Fare insancıl bir bitiş noktası olur ve Tablo 1′ deki ve aşağıda özetlenen ötenazi gerektirir olup olmadığını belirleyin. Fareler içine farklı keşfetmiş ve 4.3 ve 4.4 numaralı adımlarda belirtildiği izleme gözlemler temel hareketlilik düzeyleri sınıflandırır. Fare hareket eden her iki tarafı için ölçülür ve mobil davranış fare ötenazi gerekli olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Herhangi bir fare (a) FTR-Nonmobile veya (b) FTR-uyuşuk refleks ve bulunan bir düzeltilmesi ile insancıl bir uç nokta olduğu için yuvadan ayrılmış atayın. Bu fareler sonunda hastalığa yenik düşer ve yapmak değil yüksek doğrulukta sunulan veri tahmin çünkü zaman puan 20 h postchallenge ötesinde kontrolü, herhangi bir fare “başaramamak-e doğru sağ” insancıl bir uç noktada olarak her iki tarafta iyileştiren bir refleks ile sınıflandırmak yeniden elde etmek. 4.5. adımda belirlenen euthanized üzere olan ayrı fareler. İzlenen fare gibi bir insana ilişkin uç noktada görmedim, baraj olmadan yeni kafes içinde belgili tanımlık ikinci boş yuva yerleştirin ve diğer neonatal fareler ile devam. Bir kez tüm çöp izlenen, iç içe geçmiş malzeme yarısını yenidoğan fareler için orta odası ile bir yuva reform Barajı ile kafes içine taşıyın.Not: Düzgün biçimlendirilmemiş bir yuva dağılım ve baraj sunabilir kullanılabilir bakım azaltmak fareler neden olabilir. Yenidoğan fareler geri içine belgili tanımlık kafes baraj ile aktarın. Çöp içinde belgili tanımlık yuva üzerinde çöp artık iç içe geçmiş malzeme koyarak ve yavaşça yerde iç içe geçmiş malzeme güvenlik altına almak için kapağı çevresinde pinching alın. Adım 4,6 yerel kurum ihtiyaçlarına göre ayrılmış yenidoğan fareler ötenazi. 5. cecal Bulamaç titrasyon Fareyi istenen meydan doz (Bölüm 3), meydan ve sonuçları (Bölüm 4) izleyebilirsiniz. Nihai sonucu istenen LD sonuçlanıp sonuçlanmayacağını gözlemlemek ve değilse, Bölüm 3 ve 4 ile % 5-10 oranında ayarlama bir daha yüksek veya daha düşük zorluk doz adlı yeni bir çöp tekrarlayın.Not: Challenge dozlarda Şekil 1B için benzer ama titered her tesis ve fareler suşu olmak gerekir. Ayrıca, fare daha hızlı veya daha yavaş Şekil1B beklenen kinetik daha insancıl bir son nokta elde etmek ve Bölüm 3 ve 4 ile % 5-10 oranında ayarlama bir daha yüksek veya daha düşük zorluk doz adlı yeni bir çöp tekrar olup olmadığını gözlemlemek.

Representative Results

Cecal Bulamaç canlılığı-80 ° C’de depolanan seri olarak sulandrarak ve aliquots %5 koyun kan tryptic soya agar, aerobik kuluçka 37 ° C’de 24 saat takip üzerinde cecal Bulamaç stokunun kaplama zamanla sınanabilir Sonraki culturable koloni oluşturan birim (CFU) içeriğini cecal Bulamaç hazırlık sayma değil değişmek 6 aylık bir süre içinde bulundu ve canlılığı-80 ° c (Şekil 2) uzun süreli depolama etkilenen değil. Her donör fare, ortalama 3-4 çöp (veri gösterilmez) meydan okumak için yeterli cecal Bulamaç içinde sonuçlandı. Challenge 12 h içinde insana ilişkin son noktana ulaşmak üzere fare polymicrobial sepsis ikna etmek için cecal Bulamaç ile DOL 7’de meydan başladı ve polymicrobial sepsis çoğunlukla birleşiminden bir Kaplan-Meier sağkalım eğrisi içinde gözlemlediği gibi 48 h postchallenge tarafından çözüldü 200 meydan fareler (Şekil 1A)’den fazla veri. Ölümcül meydan doz sonuçlanan bir % 5 değişiklik ile yönetilen meydan doz bağımlı bir sağkalım oranı (Şekil 1B) kabaca % 15 fark. Fare vücut ağırlığı izleme her ziyarette ölçüldü. Kilo kaybı yaşayan kadar sona erdi fareler ve bu da ilk 24 h (Şekil 1 c) postchallenge değil arasında ayrım olmak tüm meydan hayvanlarda görüldü. 24 saat sonra bütün nonsurvivors kilo kaybetmeye devam etti ve onların insana ilişkin bitiş noktasına taşındı kendi ağırlığı, yeniden elde etmek en hayatta kalan hayvanlar başladı. Ancak, küçük bir oran aynı zamanda kilo vermek için devam onların iyileştiren refleks muhafaza ve kilo, deneme, hatta kadar 40 h Challenge içinde onların ilk vücut ağırlığının kaybetme sonuna kadar başarısız hayvanlar hayatta. Kilo kaybı arasında günümüze kadar sona erdi fareler ve did değil bu bir çakışma olduğu ağırlık veya kilo kaybı bir eşik değişikliği bir ölçüt olarak insana ilişkin son nokta için hala doğru bir şekilde hayatta kalan bölme amacı koruyarak kullanılamaz nonsurvivors. Fareler davranışını protokol ve Tablo 2özetlenen takip. Anlık görüntülerini kategorilerdir sağlık (Şekil 3A-C) görüntülenir. Bu fotoğrafları kim başarısız kendilerini onların arkasına yerleştirilen sonra sağ ve FTR-Mobile ve FTR-uyuşuk, arasındaki fark önemli bir fark olduğu anahat fareler farklı sağlık kategorilerini göster. Bu çağın tartışmasız sağlıklı fareler FTR uyuşuk faaliyet gösterme; Bu nedenle, bu sağlık kategori hastalık ve bir yanıt-e doğru meydan okumak bir belirtecidir. Hasta fareler FTR uyuşuk belirtiler (Şekil 3B) görüntülenen ve FTR-nereye üst bacak alt bacak ile paralel olarak kalır, Nonmobile doğru (Şekil 3 c), gerileme az sıfır kalça hareketi, sallanan ile ölçütlerini biri olan insana ilişkin son nokta. Fareler de, artan kalça hareketi kazanıyor ve haline geri alabilirim FTR-Mobile (Şekil 3A). İyileştiren refleks ve hareketlilik puanları hem sol hem de sağ tarafında her fare için belirlenmiştir ve en yüksek puanı fare insancıl bir bitiş noktası ulaşmış olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Davranışsal bilgi 240 hayvanlar cecal Bulamaç öldürücü dozu 60 (LD60) ile meydan yerinden toplanan ve 144 insana ilişkin bitiş noktaları (şekil 3D-F ve Tablo 1) gözlendi. Bu kanıt temelli yaklaşım tanımlamak ve hayatta kalan ve nonsurvivors arasında her iki davranış farklılıkları bağlı Denemecileri göre kategorize ve insana ilişkin bitiş noktaları ulaştı sayısına göre dört hastalık aşaması boyunca insana ilişkin son nokta rafine için kullanılan her zaman dilimi içinde. Erken deneyler sırasında kalça hiçbir hareket vardı FTR-Nonmobile fareler sürekli olarak varlık dikkat etmek bu davranış içinde ölü 4-6 h bulundu. Sunulan bilgi toplama, FTR-Nonmobile sistem durumu puanı insancıl bir son nokta için ölçüt olarak kullanıldı. 12-21 h postchallenge, FTR-Nonmobile fareler euthanized iken, hayatta kalan ve nonsurviving hayvanlar çok benzer davranış kalıpları görüntülenen ve başka bir şekilde (3D şekil) ayırt edici olamazdı. 21-48 h postchallenge, onların iyileştiren refleks fareler hayatta çoğunluğu ele geçirdi, gitmek hayvanlarda gözlenen FTR davranışları % 1’den az iken deneme (3E rakam) hayatta kalmak. Böylece, kendilerini her iki taraftan sağa başarısız fareler bu süre içinde insana ilişkin son nokta için ek bir kriter oldu. 12 ve 20 s postchallenge arasında insana ilişkin bitiş noktaları toplam sayısı % 12,5, ,5 20 ve 48 s arasında ve % 7’si karşı 48 h (Tablo 1) sonra tespit edildi. Fareler arasında ayırt edici bir özelliği günümüze kadar sona erdi ve bu insancıl bir son nokta için sonunda kötüleşti iyileştiren refleks, kalça hareketliliğini (Şekil 3F) bağımsız kaybı oldu. Nitekim, meydan sonra 20 ve 48 h arasında toplam 121 farelerin kendilerini 116 sonunda (değil kurtarmak fareler belirlenmesinde doğruluk gösteren) insancıl bir son nokta için ilerliyor bu fare ile her iki taraftan sağa doğru başarısız olmuştu. Meydan sonra 48 saat 11 fareler kendilerini her iki tarafı ve 10 / ilerledikçe bu bir insana ilişkin son nokta ( doğruluk) için sağa doğru başarısız tespit edildi. Meydan sonra 20 h, her iki taraf için iyileştiren refleks kayıp fareler sayısı fazla % 90 bir doğruluk ile nihai sonucu öngörür; Bu nedenle, bu nonrecovering fareler daha önce belirlemek ve fare (Tablo 1) acı azaltmak için insana ilişkin son nokta ölçüt için eklenmiştir. Fareler izlenmesi gerektiğini frekans Tablo 1′ de ana hatlarıyla ve ölüm postchallenge, farklı oranlarda nedeniyle zaman içinde değişir. Bir fare kendisi değil başarısız olmuştu Eğer herhangi bir noktada insana ilişkin onun uç noktada olarak kabul edildi ve nonmobile kalça hareketi her iki tarafta da görüntülenen veya fare yuvadan dağınık bulundu kendisi sağ açamadı ve uyuşuk kalça hareketi vardı. Sunulan bilgiler bu büyük gösterildiğinden bu durumlardan herhangi biri ile fareler çöp yeniden katılmak ve FTR-Nonmobile 4-6 h. başlayarak 20 h içinde olmak sonra meydan okumak için gözlenen edebilmek için beklenen değil, yeni bir insana ilişkin son nokta eklenmiştir FTR her iki hastalık için succumbing biter fareler çoğunluğu. Videolar, tablolar ve bu el yazması sunulan kaynakları bir etkili öğretim meydan fareler doğru davranış tayini için kaynaktır. Yedi Denemecileri eğitim videosunu izleyin ve protokol ve tablolar için 60 meydan hayvan davranışları atamadan önce okumak istendi. İnsana ilişkin son nokta atama tanımlaması ayırt edici FTR-Nonmobile fareler–dan diğer davranışlar (Şekil 4A) görüntülenen fareler ve FTR fareler üzerinden izin verilen zaman çerçevesi () içinde kendilerini sağa doğru başardık fareler için hem de doğru Şekil 4B). Resim 1 : Kaplan-Meier sağkalım eğrisi, cecal Bulamaç doz titrasyonu ve cecal Bulamaç meydan takip kilo değişikliği. (A)hayatta kalma sonucu yenidoğan C57BL/6J farelerin DOL 7 de bir mayi cecal Bulamaç enjeksiyon ile meydan. Bu rakam için verileri üzerinden birden fazla meydan 0.7 1,3 gram vücut ağırlığı başına cecal Bulamaç mg arasında değişen dozlarda, bu fareler için yönetilen kullanarak bağımsız deneyleri kombine edilmiştir. (B) yenidoğan fareler 0.80-0,95 gram vücut ağırlığı başına cecal Bulamaç mg ile bir cecal Bulamaç hazırlık meydan doz bağımlı bir ilişki arasında cecal Bulamaç verilen miktarı ve hayatta kalma yüzdesini görüntüler. (C) meydan okuma kilo kilo meydan zaman % 20 kaybı ifade eden noktalı çizgi ile karşılaştırıldığında ağırlık değişiklik yüzdesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : CFU konsantrasyon cecal Bulamaç hisse senedi-80 ° C’de depolanan 6 aylık bir süre içinde değişmez. Cecal Bulamaç yaş etkisi CFU konsantrasyon doğrusal regresyon kullanarak test edildi. Her noktası aynı cecal Bulamaç hazırlık seri olarak seyreltilmiş ve 6 aylık bir süre içinde kaplama bir aliquot temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Kalça hareketlilik Kategoriler kendilerini sağa başarısız farelerin ve çeşitli postchallenge kez, hayvan davranışları. Sepsis ile onların arkasına yerleştirildiğinde meydan var fare ölçülebilir hastalık belirtisi kalça hareketi derecesini görüntüler. (A) A başaramamak-e doğru sağ (FTR)-mobil fare yatay açı 90 ° aşan onların üst bacak kalça sallanan hareketi gösterir. (B) bir FTR-uyuşuk fare hareketi sallanan gösterir kalça ama 90 ° açı 4 sırasında herhangi bir noktada yatay aşmadığı izleme s. (C) bazı FTR-fareler onların bacak, diz bükme uzatacaktır ama çok az (10 °’lik açılarla daha az)-ecek göstermek sıfır kalça ve bacaklar hareket sallanan Nonmobile birbirine paralel kalacak. (D) hayvan davranışları 12-21 h postchallenge göstermek sadece FTR-Nonmobile davranışlar nonsurvivors kurtulanların ayırmak. (E) 21-48 h postchallenge kurtarmaya izin kurtulanlar için sadece 4 dışarı-in 592 gözlenen FTR davranışlar (%0.67) ait nihai sonucu tahmin etmek ve yeni bir kriter insana ilişkin son nokta için kullanılan refleks. (F) ötesinde 48 h postinfection, iyileştiren bir refleks vardı 6 dışarı-in 131 fare (%4,55) FTR grubun bir parçası olmak için gitti ve kurtarma ders boyunca sürekli izleme haklı deney sonunda kurban edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Öğretim kaynakları neden bağımsız Denemecileri tarafından doğru davranış sınıflandırma. Bu iletişim kuralı eşlik eden video izleyerek eğitimli Denemecileri farklı sağlık gruplar halinde videoları 60 yenidoğan farelerin kategorize. (A) yeteneği insancıl bir bitiş noktası ayırt etmek için kararlı ve FTR-Nonmobile fareler sadece % 1’i tanımlanmış ise ortalama % 97 oranında davranışları doğru FTR-Nonmobile ya da değil, kategorize edildi. Farelerin yüzde iki yanlış FTR-Nonmobile tespit. Doğru FTR fareler veya bu kendilerini 4 içinde sağ yeteneği olan arasında ayrım (B) ikinci insana ilişkin bitiş noktası kimliği kriter sırt konuyor, s doğru scorings, tek iken % 97’si atandı farelerin yüzde 0,96 yanlış kendilerini kurtarmaya olarak atanmış ve fareler % 2’si yanlış FTR ayrıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Hastalık sahne Re: yüksek morbidite, mortalite yok B: yüksek morbidite, düşük mortalite C: yüksek morbidite, yüksek ölüm oranı D: düşük morbidite, mortalite düşük Saat mücadele sonrası 0−12 12−20 20−48 > 48 Frekans kontrolü 2 h post challenge her 4−6 h Her 4−6 h, 8 h, gecede katılımsız 1−2 her gün, daha fazla gerekirse kez Gözlenen toplam insana ilişkin bitiş noktaları oranı 0/144 18/144 116/144 10/144 Gözlenen insana ilişkin bitiş noktaları yüzdesi % 0 % 12.5 ,5 % 7 İnsana ilişkin son nokta ölçütleri 1. her iki tarafta FTR−Nonmobile 1. her iki tarafta FTR−Nonmobile 2. yuvadan dağınık ve FTR−Lethargic olduğunu 2. yuvadan dağınık ve FTR−Lethargic olduğunu 3. FTR sol veya sağ tarafında (ile herhangi bir hareketlilik puanı) Tablo 1: hastalık farklı aşamalarında izleme ve insana ilişkin son nokta ölçütünde sıklığı. Frekans kontrolü, insana ilişkin bitiş noktaları gözlenen, insana ilişkin bitiş noktaları ve insana ilişkin son nokta ölçüt yüzdesi hastalığı farklı aşamalarında. Refleks düzeltilmesi Hareketlilik Zaman sınırı arkasına yerleştirilen sonra sağa Hareket (mobil / uyuşuk / nonmobile) miktarı ölçmek için zaman sınırı Hareketlilik Puanlama ölçütünü Hakları Cep 4 s Ek 8 s Fare ileri ivmeyi, bir satırda birden çok adımı alır ve çevresine araştırıyor. Yavru düşecek değil. Uyuşuk Fareyi bir adım ama durdurabilir ve başka çekmeden önce duraklatın. Yavru düşebilir. Nonmobile Fareyi herhangi bir adım kendisini kurtarmaya sonra almaz. Yavru düşebilir. Sağa başarısız Mobil kalça Aynı 4 iyileştiren refleks ölçmek için kullanılan s Ötesinde en az bir kez içinde 4 yatay üzerinden 90 ° döner üst bacak ile enerjik kalça hareketi vardır s. Uyuşuk kalça Kalça hareketi kadar ama 90° yatay üzerinden değil ötesinde. Nonmobile kalça Bacaklarda genişletme ve geri çeker hareket edebilir ama kalça değil dönüşümlü olarak yayınlanır. Yavru çok hasta görünüyor. Tablo 2: izleme tablo ve sistem durumu puanı farelerin belirlemede ölçüt. Sağlanan ölçütleri fareler için sağlık kategori grupları tanımlamak ve sağlık puanları atanmasında bireysel varyans azaltmak için kullanılmıştır.

Discussion

Doğum sonrası yenidoğan fareler var çok sınırlı mobilite ve kendilerini onların back on ne zaman bile tartışmasız konuyor sonra sağ için başarısız. DOL 7 tarafından yaş bu modelde, meydan fare hareketi hakları-Mobile FTR-cep telefonunuza kapsayan bir dizi önemli bir farkı, tartışmasız farelerde yani gözlendi tartışmasız bir fare bu yaşta FTR uyuşuk davranışı göstermedi. Meydan polymicrobial sepsis ile fareler olmak gözlendi FTR-uyuşuk; Bu nedenle, bu yanıt hastalık şiddeti bir işaret olabilir. Kalça hareketi için yatay gelen bir 90 ° açıyla kesme için özenli olmak uyuşuk veya mobil kalça hareketi farelerde tutarlı ve doğru tayini için sağlar. Zaman dilimi 4 s bir fare kendisi değil eğer görmek için tartışmasız fareler sürekli olarak kendilerini bu zaman dilimi içinde sağa doğru çünkü seçildi. Tekrarlanan aynı fare ölçümü kaçınılması, kendilerini sağ için zaman ve kalça hareketlilik ölçümü için 4 sınırlı s Aksi takdirde gıda ve sıcaklık elde etmek için yeteneğini etkileyebilir ve etkileyebilecek fare, aşırı yorucu önlemek için onun prognoz daha iyi olmak. Kendisi hem sol hem de sağ tarafındaki keşfetmiş gözlendi ve puanları daha yüksek kullanılan fare insancıl bir bitiş noktası olup olmadığını belirlemek için FTR-Nonmobile bir tarafta görüntülemek için bazı fareler bulunduğundan henüz diğer tarafında ve b daha yüksek bir hareketlilik var e sonunda kurtarabilirsiniz.

Fare sistem durumunu değerlendirmek için kullanılan puanlama sistemi kategorik cutoffs uygulanması için hareket bir spektrum nedir dayanıyordu ve bu nedenle, bireysel önyargı eğilimli olabilir. Personel birlikte her kişi fareler aynı attı emin olmak için eğitim gördü; Ancak, büyük olasılıkla öznellik varyasyon için önde gelen bir seviyede kalır. Puanlama tutarlılığını yedi alarak değerlendirildiğinde daha önce yenidoğan fare izleme gerçekleştirilen vardı değil araştırmacılar bu protokolü ve video gereklere öğrenmek, bağımsız olarak davranışları atamak ve insancıl belirlemek bitiş noktası. %97 doğruluk bireysel önyargı bu model davranış atamaları önemli bir rol oynamıyor düşündüren 60 meydan fareler üzerinde yapılan Puanlama ile gözlenmiştir. Sunulan davranış izleme protokolü üzerinde DOL 7 meydan hayvanlar gözlemleri dayanır, henüz tartışmasız bir sağlıklı devlet 6 gün genç farelerde, sürekli olarak kendilerini değil. Böylece, açıklanan insana ilişkin son nokta ölçütleri doğrudan küçük fareler için uygulanamadı. Küçük fareler bu deneysel modelinde kullanılan veya farklı meydan modeli ile farklı hastalık kinetik uygulanırsa, sonra uygun insana ilişkin son nokta ölçütleri olmalı geliştirilen ve ötenazi istiyorsunuz yoksa, sonunda farelerin önlemek için pilot yeniden elde etmek. Skor sistemi test ve onaylama ile diğer modeller için potansiyel olarak uygulanan olabilir bu insancıl bitiş noktası sınıflandırma artırma sağlam bir yöntemini görüntüler.

Cecal Bulamaç her hazırlanması veya yeni bir fare türü kullanımı benzer bir öldürücü doz elde etmek için yönetmek için cecal Bulamaç doz retitration gerekli. Her hazırlık tarafından ilgi, yani hayatta kalma, okuma standartlaştırılmış aynı bakteri sayısı vermek yerine. Her cecal Bulamaç hazırlık’ın uygun bakteriyel konsantrasyon biraz, potansiyel donör komensal bakteriler farklılıkları nedeniyle veya’deki ağırlığı nedeniyle çeşitli cecal Bulamaç hisse senedi postfiltration hücre süzgeç yaptı. Cecal Bulamaç titrasyon sırasında ilk iki çöp iki gruba ayrıldı ve çöp her yarı doz her iki çöp test edilir böylece iki doz biri ile meydan. Elde edilen sağkalım oranı gerekli seviyesi eşleşmedi, mücadele dozun ya artırılması veya % 5-10 oranında azaltılması ve deneme tekrarladı. Birden çok çöp çöp çöp fark bu direnç neden olabilir veya bir çöp sepsis duyarlılık arttı hesaba kullanılmıştır. Doğru bir şekilde titresi cecal Bulamaç yeni titrasyon önceki cecal Bulamaç hazırlıkları için karşılaştırılabilir emin olmak için her yeni hazırlık ile cecal Bulamaç stok için önemliydi. Aşırı gürültü ve titreşim özellikle asfalt ve yakındaki bina ve road, inşaat düzenleme işlemi sırasında bir süre barajlar stres artırmak için tespit edildi. Bu markada artış oranları ile ilişkili ve ölüm bile tartışmasız fareler, ayrıca için denetlenmesi gereken yenidoğan sağkalıma yabancı etkileri olabileceğini belirten etkileyen yaşam deneyler etkiledi.

Cecal Bulamaç hisse senedi hazırlık için önceki yöntemleri dahil taze cecal Bulamaç kullanımı ya da kaçınılmaz olarak meydan okuma sırasında transfer olacağı gliserol içinde depolama gibi yöntemleri kullanarak donmuş cecal Bulamaç hazırlanması. Taze cecal Bulamaç kullan bakteriyel kompozisyon orijinal cecal içindekiler-e doğru en yakın sahip olmanın avantajı sağlamasına karşın, bireysel donör fareler komensal bakteriler varyasyonu nedeniyle arasındaki farkları riski vardır. Bu geliş ve denemenin ilerlemesi arasındaki en az süre ile aynı satıcıdan cecal bağış kullanarak minimize iken, bu bazı laboratuvarlar için maliyet engelleyici bir seçenek haline gelebilir ve sahip başka bir zamanlama lojistik meydan okuma sundu Fareler cecal bir bulamaç başlıyor ne zaman kullanılabilir yaş eşlemeli 7 günlüktün yenidoğan farelerde deney. Burada birden çok yetişkin bağış cecal içeriği havuza alınmış, D5W, gliserol, olmadan-80 ° C arasında dondurulup resuspended ve deneyler için bir seferde bir aliquot çözdürülen taze cecal Bulamaç kullanarak alternatif bir yöntem kullanılmıştır. Yetişkin donör cecal Bulamaç neonatal sepsis çalışmaya kullanımı potansiyel olarak bakteri yenidoğan fare için maruz kaldığı şiddete güzel değil cecal Bulamaç mevcut türleri transfer olabilir, ancak farelerde neonatal sepsis incelenmesi için izin veren bir strateji ve Yenidoğan fare biyoloji son13,14,15dakika içinde çalışmaya kullanılmıştır. Cecal Bulamaç bakteri enjekte edildi ve besin Periton boşluğunda kullanılabilirliğini Nekroze edici sırasında taklit etmek için yapıldı sonra aktif bir bulaşmayı kuruluş izin bakteriler, beslenme sağlamak için D5W düşürülmüştü enterokolit. Gliserol gliserol enjeksiyon tek başına ortaya çıkabilecek olası olumsuz yan etkileri nedeniyle bakteri dondurma teskin bir ajan olarak dahil değildi. Gliserol cecal Bulamaç hazırlanmasında eklediyseniz, o zaman potansiyel zarar o gliserol yalnız neden bir salt gliserol (eksik olan cecal Bulamaç) ekleyerek için test edilecek enjeksiyon artmıştır farelerde kullanım fare. Cecal Bulamaç stokları bakteri canlılık gliserol olmadan cecal Bulamaç stok dondurma sonra test edildi ve sürekli aynı cecal Bulamaç hazırlık 6 üzerinde-80 ° C’de depolanan ayrı aliquots bakteri konsantrasyonu hiçbir değişiklik ile bulundu aylık süre. Bu depolama gliserol olmadan tutarlı bir biyolojik sonuç sağlayan uygun olduğunu göstermektedir. Bir toplu-hazır cecal Bulamaç hisse senedi donmuş kullanımı da maliyet azaltma ve başka doğurmak gelen aşırı olacağını erkek fare kullanmak, bu nedenle fare israfını azaltmak şirket içinde yetiştirilmiş fare kullanımı için izin verdi.

Farelerde başarısız zorluklar tanımlaması sisteme ilave gürültü ekleyerek önlemek önemliydi. Mayi enjeksiyonu cecal Bulamaç geçiyor sonra fareler için aslında subkutan başarısız bir enjeksiyon belirtilen cilt altında bir çıkıntı varlığı tespit edildi. Fareler gözlendi kaçakları enjeksiyon yerinde hemen sonra iğne kaldırma ve sonra onları enjeksiyon sonra bir adım atmak izin çünkü fareler bazen (nadiren) kaçak sadece bir adım alarak enjeksiyon yeri uzuv taşıdıktan sonra. Bir çıkıntı veya enjeksiyon takip sızıntı varlığı analiz fare giderilmesinde sonuçlandı. Sonuçta, ya bu cecal Bulamaç enjekte meydan doz % 5 farklılığı sonraki hayatta kalma etkilemeye gözlemlediği gibi yanlış miktarı nedeniyle farklı bir sonuç neden olabilir.

Cecal Bulamaç meydan ağırlık ayarlanmış dozlarda değişen kez gerekli değişen hedef öldürücü doz deneyleri. Bu nedenle, az 20 µL gelen ve en fazla 100 µL enjeksiyon birimleri arasında olabilir. İlişkili orantılı deneysel hata ölü iğne ile cilt de doğrudan farklı dozlarda karşılaştırmak için zorluk artan enjeksiyon hacmi ile birlikte değişir. Enjeksiyon hacmi standartlaştırılması basit değişiklik ile bu kaynak bir varyans deneyden kaldırılır.

Bu protokol için kullanılan yenidoğan fare davranış izleme sistemi türünün ilkidir. Yeni doğan fareler ile etik araştırma araştırmacılar niyet kez zorlu hayvan refahı bu yaşta değerlendirmek için kaynak yetersizliği ile karşı karşıya. Bu bilgi boşluğu adrese sunulan sezgisel ve tutarlı izleme sistemi başlar. Önemlisi, bu kanıt temelli yaklaşım elde edilen deneysel verilerin kalitesini artırır kalmayıp, aynı zamanda da deneysel hayvan acı azaltır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onların rehberlik ve hayvan izleme ve su kuyusu-varlık giriş için özel Claire Harrison ve hayvan bakım tesisi, British Columbia Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü (BCCHR) destek için hayvan çalışmalarında, hem de doktor Po-Yan Cheng için teşekkürler.

Materials

0.1 – 20 μL pipette tips VWR 732-0799
1.8 mL Microcentrifuge tube Costar 3621
100 – 1000 μL pipette tips VWR 732-0801
1 – 200 μL pipette tips VWR 732-0800
15 mL Centrifuge tube FroggaBio TB15-25
23G1 needles Becton Dickinson 305145 only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam
28G 0.5 mL Insulin syringe BD 329461
2 mL Cryogenic vial Corning 430488
50 mL Centrifuge tube Fisher scientific 14-432-22
5 mL pipette Costar 4487
6 – 10 week old C57BL/6J adult mice Jackson Laboratories 664
7 + day old C57BL/6J neonatal mice Bred in house n.a
70 μm Cell strainer Falcon 352350
Defibrinated Sheep's Blood Dalynn HS30-500
Dextrose 5% Water (D5W) Baxter JB0080
Dissecting forceps VWR  82027-386
Dissecting Scissors, Sharp Tip VWR  82027-592
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip VWR 82027-594
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) Fisherbrand HC11001GL diluted to 70% with double distilled water
Ethanol-proof marker; Lab marker VWR 52877-310
EZ Anesthesia Vaporizer EZ Anesthesia EZ-155
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) Braintree Scientific GER 5287-120V
Isoflurane Fresenius Kabi CP0406V2
Micro Spatula Chemglass CG-1983-12
Pipette-Aid Drummond 4-000-100
Rainin Classic Pipette PR-1000 Rainin 17008653
Rainin Classic Pipette PR-20 Rainin 17008650
Rainin Classic Pipette PR-200 Rainin 17008652
Scale Sartorius BL 150 S
Specimen forceps VWR 82027-440 / 82027-442
Square 1000 mL Storage Bottle Corning 431433
Styrofoam board Any n.a
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber Euthanex EZ-178
Tryptic Soy Agar Sigma-Aldrich 22091-2.5KG
VX-200 Lab Vortex Mixer Labnet International S0200
weigh paper Fisherbrand 09-898-12B
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
  2. Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
  3. Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
  4. Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
  5. Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
  6. Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
  7. Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
  8. Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
  9. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
  10. Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
  11. Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
  12. Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
  13. Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
  14. Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
  15. Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
  16. Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
  17. Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
  18. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
  19. Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
  20. Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
  21. Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
  22. Canadian Council on Animal Care. . Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , (1998).
  23. Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. Humane endpoints in shock research. SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).
  24. Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).

Tags

Neonatal Polymicrobial SepsisCecal Slurry ModelStandardized ProcedureData-driven ApproachMoribund PupsFrozen Cecal Slurry StockCecal ContentsDissectionSterile ToolsBiological Safety Cabinet

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Brook, B., Amenyogbe, N., Ben-Othman, R., Cai, B., Harbeson, D., Francis, F., Liu, A. C., Varankovich, N., Wynn, J., Kollmann, T. R. A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis. J. Vis. Exp. (143), e58574, doi:10.3791/58574 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image