قطب الصغير-أجار ملح جسر لتحليل معدل دوران بروتون بروتينات الغشاء المؤتلف
Summary
في القياسات الكهربية، تزعج وجود انتشار محتمل القياس الدقيق لاحتمال عكس بتغيير مسرى المحتملة. استخدام جسر ملح الصغرى-أجار، يتم تصغير أثر نشر المحتملة، التي تتيح قياس أكثر دقة من الركازة دوران أرقام من البروتينات الغشاء المؤتلف المعاد تشكيلها.
Abstract
وحتى الآن، تستهدف أكثر من 50 في المائة من جميع العقاقير الدوائية حركية النقل من غشاء بروتينات. توصيف الكهربية من البروتينات الناقل غشاء تشكيلها في الأغشية الدهنية بلير وسيلة قوية ولكن حساسة لتقييم الخصائص الفيزيائية الكيميائية والصيدلانية الخاصة بهم. عدد دوران الركيزة هو معلمة فريدة من نوعها تتيح المقارنة بين نشاط البروتينات الغشاء مختلفة. في نقل وآﻻت، يخلق تدرج الركازة ذوبانها غشاء محتملة الذي يرتبط مباشرة بمعدل دوران الركيزة من البروتين. باستخدام أقطاب كلوريد الفضة، هو فعل إمكانية نشرها، كما دعا تقاطع السائل المحتملة،، الذي يغير إمكانات القطب وتزعج القياسات المحتملة غشاء دقيق إلى حد كبير. يمكن التقليل من انتشار محتمل عن طريق جسر ملح، الذي يوازن بين الإمكانات قطب كهربائي. في هذه المقالة، جسر ملح الصغرى-أجار تهدف إلى تحسين البنية الكهربية، الذي يستخدم ميكروبيبيتيس لتشكيل الغشاء. الحل الملح يتم ملؤها في تلميح ماصة ميكروكابيلاري، استقرت بالإضافة [اغروس]، ويمكن تركيبة بسهولة على قطب قياسية. إمكانات القطب القطب الجسر الصغير-الملح أكثر استقرارا مقارنة قطب قياسية. تنفيذ هذا النظام استقرار القطب المحتملة ويسمح قياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة الناتجة عن تدرج درجة حموضة. باستخدام هذا النظام، بإغﻻقها معدلات دوران بروتون الناقلين المتقدرية UCP1 و UCP3 ومقارنة بالقياسات السابقة.
Introduction
وتستهدف بروتينات الغشاء تصل إلى 60 في المائة من جميع العقاقير الصيدلانية المعروفة1. القياسات الكهربية من البروتينات الغشاء أداة قوية ولكن حساسة لتحليل النقل وآﻻت من ركائز توسط بروتينات الغشاء الناقل. يسمح التعديل الحالي ترانسميمبراني من تطبيق الفولتية ثابتة أو سلالم الجهد تقييم الخصائص الدوائية والفيزيائية من شركات النقل، وعلى سبيل المثال، تفعيل وتثبيط من ركائز أو النقل حركية. الاهتمام الخاص هو عدد دوران الركازة، الذي يعرض مقدار الركيزة التي يتم ذوبانها بروتين غشاء كل وحدة وقت. أنها معلمة رئيسية عند مقارنة حركية مختلف البروتينات الغشاء. إنشاء تدرج تركيز من الركازة المشحونة عبر الغشاء يولد قوة الدافعة الكهربائية يستخلص منها عدد دوران الركازة.
استخدام قطب AgCl، وجود منطقة عازلة خالية من كلوريد يخلق إمكانية نشرها أن يغير مسرى المحتملة ويؤدي إلى تحول في قياسات الجهد الحالي2. على الرغم من أن هذا دائماً، فإنه لا يكاد يذكر الموصلية القياسية وقياس القدرات منذ هذه المعلمات أما تعتمد على المنحدر من الجهد الحالي تسجيل (الموصلية) أو هي الفرق بين تسجيل واحد (القدرات)، التي يلغي إمكانية. بيد تسجيل إمكانية عكس، الذي يتم إنشاؤه بواسطة نقل الركازة، يمكن أن تكون إلى حد كبير انزعاج نشر المحتملة. وهكذا، للحصول على قياسات دقيقة لإمكانية عكس، إمكانات قطب كهربائي يجب أن تبقى ثابتة.
يمكن التقليل من انتشار محتمل بطريقتين: (ط) بحضور كل من غشاء بلير، تركيز الركيزة يجب أن يزاد على جانب واحد من3،الغشاء4، أو أرصدة (ثانيا) جسر ملح مسرى المحتملة 5. الطريقة الأولى تعتمد اعتماداً كبيرا على استقرار القياسات. وقد الغشاء البقاء على قيد الحياة لعدة دقائق، من إضافة الركازة تحت إثارة حتى الركيزة هي موزعة بالتساوي تقريبا في الحل. إذا كان الغشاء تصدعات في بين، هو تغيير التدرج الركيزة بالتبادل الحر للجزيئات المشحونة، وتحويل القياسات غير دقيقة. الأسلوب الأخير أرصدة نشر المحتملة غير محدودة الحجم للإنشاء. تحدي تنفيذ صغيرة ولكن عمل جسر الملح في طائفة الجزئي لإعداد الكهربية6. للأسلوب الأخير، هو الحل الملح شغلها في تلميح ميكروكابيلاري واستقرت بالإضافة [اغروس] لمنع نشر الحل الملح إلى الحل المخزن المؤقت.
ويرد في هذا البروتوكول، إنتاج مباشرة الجسر الصغير-أجار ملح والتنفيذ في إعداد الكهربية استناداً إلى إعداد ماصة7 . يتم ضبط نصيحة ميكروكابيلاري لاحتواء حل بوكل م 3 مع جزئ 1% (w/v) [اغروس] ولسد حلاً AgCl القطب والمخزن المؤقت. يتم عرض في استفادة الجسر الصغير-الملح بتسجيلات وقت التحول المحتملة القطب وقياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة في مختلف الأس الهيدروجيني التدرجات. في النظام النموذجي للبروتينات التوليفية التي أعيد تشكيلها في الدهنية، بإغﻻقها معدلات دوران الناقلين المتقدرية UCP1 و UCP3 المنتجة في ظروف مماثلة ومقارنة بالنتائج السابقة3،8.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنفيذ الجسر الصغير-أجار الملح مع مسرى يقلل نشر المحتملة ويسمح قياسات أكثر دقة لغشاء المحتملة الناتجة عن تدرج درجة حموضة. حضور مختلف الأس الهيدروجيني transmembrane التدرجات، التحول المحتملة لكل أقطاب مقبول في ΔpH = 0.35 عند مقارنة بالقيمة النظرية للتوازن] [نرنست] المحتملة (Φ] [نرنست] = 23.8 mV ل ΔpH = 0.4). ومع ذلك، في الأس الهيدروجيني الفسيولوجي تدرجات إضافية، كما لفشل مثيل في الميتوكوندريا بين المصفوفة والفضاء intermembrane، مسرى AgCl القياسية دقة قياس التحول المحتملة في ΔpH = 1 (الشكل 3أ). وألقى مسرى سدها بالملح الصغرى-أجار القيم التي أكثر بكثير مماثلة للنظرية.
نشر محتملة قد تحدث أيضا في مسرى مرجع AgCl إذا تم تغيير الحل المخزن المؤقت أثناء التجربة. الحل عازلة خالية من كلوريد استخدمت في التجارب حيث يفصل البروتينات واقترح نقل أيونات الكلوريد، وتم ضبط درجة الحموضة استخدام تريس أو مس. مسرى المحتملة، نظراً لعدم وجود تركيز كبير من الكلوريد، أساسا يعتمد على شوائب كلوريد في الحل المخزن المؤقت. كما لم يتغير تشكيلها خلال التجارب، أنه سيؤدي ببساطة إلى إمكانية إزاحة ثابتة. ومع ذلك، لقياس مطلقة الاختلاف المحتملة قطبين، نظام ملح-جسر أجار بسيط (Ag/AgCl 3 م بوكل) أيضا يمكن لمسرى مرجع.
جسر ملح الصغرى-أجار أرصدة نشر المحتملة بالموازنة القطب المحتملة. بغية تثبيت الحل الملح، تمت إضافة 1% (w/v) [اغروس] لمنع اختلاط الحل الملح مع الحل المخزن المؤقت. أيونات الملح ك+ و Cl– موبيليتيس مماثلة في السائل والتوازن الكهربائي المحتملة. تثبيت الجسر الملح بشكل صحيح، لا الحل الملح أجار يمكن تسخينه بما فيه الكفاية لملء نصيحة ميكروكابيلاري دون أي فقاعات الهواء وتغطية مسرى AgCl. قبل مواصلة الاستخدام، قد تماس كهربائي بين مسرى جسر الملح ومسرى مرجع لفحصها. وقد حل الملح حسب الوقت الذي يستخدم الجسر الملح، أن تبلور بما فيه الكفاية لمنع أي خلط الحل الملح مع المخزن المؤقت. هذا أمر بالغ الأهمية خاصة إذا كان يتم التحقيق ك+ أو الناقلين Cl– . واستخدمت الجسر الملح لفترة زمنية قصيرة جداً وشطف من [اغروس] لا يكاد يذكر في هذا النطاق الزمني. تركيز أعلى من [اغروس] ليصل إلى 5 في المائة، أو أجار (3 ٪-5 ٪)، يسمح باستخدام جسر الملح لفترة أطول من الوقت6،12.
يسمح هذا الأسلوب تحديد حركية النقل الناقل غشاء (ط) مع معدلات دوران منخفضة و (ثانيا) mitochondrial البروتينات الغشاء الداخلي، الذي لا يمكن أن يحقق في التصحيح القياسي المشبك التكوينات13. دقتها تعتمد أساسا على قياس إمكانية عكس، يتناقص فيه دقة الموصلية غشاء إجمالي منخفض والتدرجات تركيز الصغيرة التي تحفز غشاء محتملة أدناه ضوضاء تسجيل.
باستخدام هذا الإعداد، تم قياس معدلات دوران UCP1 و UCP3 كما أنتجت في نفس الظروف. بسبب ارتفاع درجة الحموضة التدرج، تبدو المعدلات التي تم الحصول عليها تكون أكثر دقة ودونما قلاقل بالآثار الناجمة عن التحول المحتملة طفيفة القطب. يمكن استخدامه لزيادة تحليل ومقارنة الناقلين غشاء الميتوكوندريا المنتجة في ظروف مماثلة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “الصندوق البحوث النمساوية” (P31559-B20 إلى E.E.P.). يشكر المؤلفون بارداكجي سارة للمساعدة التقنية الممتازة في الإنتاج وإعادة تشكيل للماوس UCP1 و UCP3 في بروتيوليبوسوميس.
Materials
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | Microcapillary pipette tip |
| Ethanol 99% | AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
| Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
| DC supply | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
| Agarose Standard | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
| Patch Clamp Amplifier | Heka | ||
| Sample tube | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
| Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
| MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
| TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
| EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
| Heating wire | Voltcraft | USPS-2250 |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).
- Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).
- Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).
- Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).
- Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).
- Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).
- Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).
- Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).
- Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).
- Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).
