אלקטרודה מיקרו-אגר מלח גשר ניתוח שיעור תחלופה פרוטון של חלבוני ממברנה רקומביננטי

1. ייצור החלבונים Uncoupling רקומביננטי (UCPs) ואת היווצרות קרום מישוריים Bilayer לייצר UCP1 רקומביננטי, UCP3 כפי שתואר על ידי רופרכט. et al. 9 ו. Hilse et al. 10 טופס bilayer מישורי ממברנות על קצות קונבנציונאלי פיפטות פלסטיק לוותר, כפי שתואר על ידי בק. ואח 7 2. הכנת האלקטרודה גשר המלח מיקרו-אגר התאם פיפטה microcapillary עצה (ראה טבלה של חומרים) באורך המתאים. סמן את המיקום על עצה ריק שבו הטיפ המכיל מאגר תצורף ולהשתמש של caliper הזזה כדי למדוד את האורך של האלקטרודה גשר המלח מיקרו-אגר.התראה: הטיפ microcapillary חייב להיות מספיק כדי להזין את בופר המדידות. לחתוך את הקצה microcapillary עם סכין חדה או להב ו לנקות את השטח לחתוך עם אתנול ומים. להכין את האלקטרודה מצופים AgCl. חתכו כבל Ag של-8 ס”מ אורך ולנקות את זה עם אתנול ומים. קחי פיסה של נייר זכוכית וחלק את פני השטח של 1 ס מ אורך בקצה של החוט, שאמור להיות בקשר עם הפתרון מלח. טבלו את הקצה מוחלקים פתרון אשלגן כלורי 3 מ’, מעיל זה electrochemically כלוריד באמצעות היצע DC ב- 1.5 V עבור 10 s. לנקות את האלקטרודה עם מים, לייבש אותו, להתאים את האורך של האלקטרודה AgCl מהצד ללא ציפוי כך הוא חודר את הטיפ microcapillary עמוק ככל האפשר.הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. להכין פתרון מלח אשלגן כלורי 3 מ’ עם agarose 1% (v/v). שוקלים לצאת 4.47 g של אשלגן כלורי, לפזר זאת בתוך 20 מיליליטר מים על ידי ערבוב זה בבקבוקון. הסר את קדירות שוקל לצאת 0.2 גר’ agarose, להוסיף את הבקבוק. לחמם את פתרון 100 ° C כדי להמיס את agarose ולמנוע ממנו קרישה.התראה: הבקבוקון יהיה חם מאוד. לא לגעת בו בידיים חשופות. להשתמש בכפפות לטיפול. למלא את הטיפ microcapillary עם תמיסת מלח agarose.התראה: הפתרון הוא חם. להגן על הידיים ועבודה בקפידה כדי להימנע פרצים. אם agarose מתחיל קרישה, לחמם את תמיסת מלח מלא להמיס את agarose שוב. משרים 10 µL של הפתרון מלח אגר לתוך קצה microcapillary. משרים אותו לאט לאט, בזהירות כדי למנוע אוויר בועות בקצה. הסר את הטיפ פיפטה, לדחוף פנימה האלקטרודה AgCl מהצד הרחב יותר של הקצה. ודא כי האלקטרודה חודר את תמיסת מלח. לקרר האלקטרודה לטמפרטורת החדר וחבר אותו לתוך המגבר. להכין את החומר הממתן המידות. שוקלים לצאת 0.710 גר’ נה2אז4, 0.195 גר’ MES, 0.121 g של טריס, 0.023 גר’ EGTA, להוסיף 100 מ של מים מזוקקים גביע ואז מערבבים את הפתרון. בדוק ערך ה-pH של המאגר באמצעות אלקטרודת pH ולהתאים את ערך ה-pH 7.32. בדוק כי האלקטרודה הפניה האלקטרודה גשר המלח אגר הם מגע חשמלית. להוסיף 1 מ”ל של מאגר במיכל פלסטיק. טובלים האלקטרודה הפניה, האלקטרודה גשר המלח אגר ולבדוק לתגובה אות. אם התגובה האות הנכונה, המשך לשלב 2.7. אם אין תגובה אות כוזב או בלי קשר חשמל בכלל, לבצע פתרון הבעיות הבאות. בדוק אם האלקטרודה היא בקשר עם הפתרון מלח, דחפו את האלקטרודה הפתרון.הערה: אם הפתרון כבר יותר מדי בעייתי, להסיר את הגשר מלח מיקרו-אגר והכן טיפ microcapillary חדש. בדוק אם יש בועות אוויר בתוך תמיסת מלח. אם כן, להכין טיפ microcapillary חדש. בדוק אם הפתרון מלח הוא קשר בופר. אם לא, ואז לחתוך עוד 1 מ מ בקצה צינור של הקצה.התראה: ודא כי הטיפ הוא עדיין מספיק זמן. כדי לחדור את הטיפ המכיל מאגר. אם יש עדיין אין קשר, להכין טיפ microcapillary חדש. אם אף אחד השלבים הבאים לסייע, להכין טיפ microcapillary חדש. לאחסון, טבלו האלקטרודה גשר המלח אגר פתרון אשלגן כלורי 3 מ’.הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור כאן. עבור הפסקה ללילה, לאחסן האלקטרודה תמיסת מלח אשלגן כלורי 3 מ’ על 4 מעלות צלזיוס. הכינו את הטיפ פלסטיק המכיל מאגר.הערה: אם האלקטרודה אוחסן בן לילה, תוציא את זה ולתת לו חום עד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. קח טיפ microcapillary, לכופף את הצינור, 2 ס”מ מהקצה של החלק הצר, כ- 90 מעלות באמצעות חוט חימום. להשתמש בסכין חדה מאוד או להב, לחתוך את הצינור בסביבות 5 מ מ העיקול. לנקות את השטח לקראת הסוף עם אתנול ומים ולמדוד את הקוטר של החור של הקצה. מכאן, לחשב את השטח של פני השטח. המעיל השטח של הקצה עם 85:15 (v: v) הקסאן: hexadecane. פיפטה 3 µL של הממס ולהסיר אותו מהקצה. חכו 1 דקות, כך כל של הממס שיורית בקצה התאדו. למלא את הטיפ מדידה עם 3 µL מאגר וחבר אותו על גבי האלקטרודה גשר מלח.הערה: בדוק שוב אם האלקטרודה גשר המלח האלקטרודה הפניה הם מגע חשמלית על-ידי ביצוע שלב הנגן 2.5.3. אם אין מגעים חשמליים, בדוק לדברים הבאים: לבדוק אם האלקטרודה גשר המלח בקשר עם בופר. אם לא, אז להגדיל את נפח המאגר בקצה או להכין טיפ microcapillary יותר. אם יש בועת אוויר, להסיר את הטיפ של האלקטרודה גשר מיקרו-מלח, למלא את מאגר המידע, וחבר אותו לתוך האלקטרודה שוב. 3. מדידה של הפרמטרים החשמלי של קרום מחדש עם חלבון רקומביננטי החלת אות מתח מתחלפים משולש עם מתח מקסימלי Umax = mV וΔT 50הרמפה = 50 מילישניות, אשר יוצר תגובה מלבני זרם חילופין. מתוך הערכים אכזרי של הזרמים חיוביים ושליליים (+ ואני–), לחשב את הקיבולת של הקרום על פי הנוסחה הבאה: החלת רמפה מתח החל מ-50 mV +50 mV, הרשומה הנוכחית. להכניס פונקציה קווית – השיפוע הוא מוליכות – על הנתונים ולחשב את נקודת ההצטלבות של ציר ה-x של התאים. הפרשות הפתרון בקצה פלסטיק ומלא אחד חדש עם מאגר המכיל ריכוז המצע מוגבר. אם אין קרום נוצר בתוך ה-20-30 s הראשון, לשחרר את עוצמת הקול, למלא אותו. זה מבטיח כי מעבר הצבע ריכוז על פני הקרום לא לשנות באופן משמעותי במהלך היווצרות קרום. לאחר היווצרות קרום, לבצע שלבים 3.1 ו- 3.2 שוב כדי לוודא היווצרות קרום נכונה וכדי לקבל את נקודת ההצטלבות של ציר ה-x. 4. חישוב של שיעור תחלופה המצע הערה: ראה עבודה קודמות עבור פרטים3,7. להעריך את כמות חלבון ממברנה מן המסה המולקולרית של השומנים חלבון (מ’השומנים Mחלבון), האזור של הקרום של השומנים אחד ראש קבוצה (קרום ,שומנים בדם), ואת היחס המונית של החלבון לכל השומנים (r). לחשב את פוטנציאל המצע מועבר נרנסט. R הוא קבוע הגז, T הטמפרטורה, z המטען של המצע מועבר, F של פאראדיי קבועה, ו- c1 ו- c2 ריכוז המצע של שני צידי הקרום. מ ההקלטות זרם-מתח, לקחת את ההפך פוטנציאליים מחושב עם ההבדל של נקודות צומת ציר ה-x מ. מתאים ליניארי נוכחות, היעדרות של המילוי ההדרגתי המצע. לחשב את הפרופורציה של המצע מוליכות, Gהמצע, כדי מוליכות הממברנה הכולל, Gהכולל, לפי היחס של הפוטנציאל להפוך פוטנציאל נרנסט11. לחשב את המצע מחזור ΔN מספרהמצע לכל ΔT יחידת זמן מוליכות את המצע (Gהמצע), המתח יישומית U, המטען של z המצע: של היחס של המצע מועבר בכל פעם על מספר חלבונים, לחשב את κ קצב תחלופת.