組換え膜蛋白質のプロトンの回転率を分析するためのマイクロ寒天塩橋電極

1. 遺伝子組換え連結を解く蛋白質 (さら) の生産と平面二重膜の形成 ループレヒトらによる記述で、UCP1 遺伝子組換え、UCP3 を生成します。9 Hilseら10 ベックらによって記述された従来不可欠であるプラスチック ピペットの先端に平面二重膜を形成します。7 2. マイクロ寒天塩橋電極の作製 マイクロキャピ ラリー ピペットを調整する適切な長さ (材料の表を参照) をヒントします。 空の先端でバッファーを含む先端に添付されます、スライド式キャリパーを使用してマイクロ寒天塩橋電極の長さを測定する位置をマークします。注意: マイクロキャピ ラリー チップはある十分な長さ測定用緩衝液を入力する必要があります。 鋭いナイフとブレード マイクロキャピ ラリー チップを切り取って、エタノールと水でカット面をきれいに。 塩化銀被覆電極を準備します。 長さ約 8 cm の銀線を切断し、エタノールと水でそれをきれいに。 サンドペーパーの部分を取り、塩溶液に接触するはず、ワイヤーの端に 1 cm の表面を滑らかに。 平滑端を 3 M KCl 水溶液に浸し、10 の 1.5 V で DC 電源を使用して塩化物の電気化学的コート s。 水で電極をきれい、乾燥させ、およびマイクロキャピ ラリー チップを可能な限り深く浸透してコーティングされていない側から塩化銀電極の長さを調整します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 1% (v/v) agarose が付いて 3 M KCl 塩溶液を準備します。 KCl の 4.47 g を量り、フラスコの攪拌で 20 mL の水に溶かします。 かくはんを取り外して、アガロースの 0.2 g を量り、フラスコに追加。 Agarose を溶かし、凝固を防ぐに 100 ° C の解決策を熱する。注意: フラスコは非常に高温になります。素手でそれを触れないでください。処理のため手袋を使用します。 マイクロキャピ ラリー チップをアガロース溶液で満たしなさい。注意: ソリューションは、暑いです。手と水しぶきを避けるために注意深く作業を保護します。 Agarose 起動凝固する場合熱再び agarose を溶かし完全に食塩。 マイクロキャピ ラリー チップに寒天塩液の 10 μ L を浸します。それをしっぽりし、慎重に先端で気泡の空気を避けるために。 ピペットから先端を外し、先端のより広範な側面から塩化銀電極でプッシュします。塩の溶液を電極に浸透を確保します。 部屋の温度に電極を冷却、アンプに差し込みます。 測定用バッファーを準備します。 その4MES の 0.195 g ナ2の 0.710 g を量り、0.121 g のトリス、0.023 g グリコールエーテルジアミン四酢酸、100 mL の蒸留水をビーカーに追加し、ソリューションをかき混ぜます。 PH 電極を使用してバッファーの pH 値を確認し、7.32 に pH 値を調整します。 参照電極と寒天塩橋電極では、電気的接触を確認してください。 プラスチック製の容器に 1 mL のバッファーを追加します。 参照電極と寒天塩橋電極ディップし、信号の応答を確認してください。信号応答が正しい場合は、2.7 の手順に進みます。 まったく偽信号応答または電気的接触がある場合、は、次のトラブルシューティングを実行します。 塩溶液との接触電極が確認してくださいし、溶液に電極をプッシュします。注: ソリューションは、あまりにも粘着が既にいる場合、マイクロ寒天塩橋を取り外して、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。 塩の溶液内の空気の泡があるか確認してください。Yes の場合、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。 塩溶液緩衝液との接触が確認してください。されていない場合は、別 1 mm の先端の管端を切断します。注意: 先端はバッファーを含むヒントを貫通する十分な長さではまだされていることを必ずです。まだ接触がない場合は、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。 上記の手順が役立つ場合は、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。 ストレージの 3 M KCl 水溶液に寒天塩橋電極を浸し。注: プロトコルをここで停止することができます。一時停止のため一晩、4 ° C で 3 M KCl 塩溶液に電極を格納します。 バッファーを含むプラスチック チップを準備します。注: 電極が一晩保存、する場合それを取り出し、それまで室温で 30 分間熱。 マイクロキャピ ラリー チップを取るし、電熱線を使用して約 90 度、狭い部分の端から 2 cm のチューブを曲げます。 非常に鋭いナイフや刃を使用し、管の曲がり部から約 5 mm を切断します。 エタノールと水で最後に表面をきれいにし、先端の穴の直径を測定します。このことから、画面の領域を計算します。 85:15 (v): ヘキサン: ヘキサデカンで先端の表面をコートします。 溶媒の 3 μ L をピペット、先端から取り外します。 先端における残留溶媒のすべてが蒸発したように 1 分の待機します。 バッファーの 3 μ L で測定チップを埋める、塩橋電極上に差し込みます。注: は、2.5.3 のステップを実行することで電気的接触、塩橋電極と参照電極場合もう一度確認します。 電気的接触がない場合は、次のチェックします。 塩橋電極が緩衝液との接触はあるかどうかを確認します。そうでない場合は、どちらかは先端でバッファーのボリュームを増加したりより長いマイクロキャピ ラリー ヒントを準備します。 空気の泡のマイクロ塩橋電極から先端を削除、ヒントでは、バッファーを補充、電極に再びそれをプラグインがある場合。 3. 組換えタンパク質再構成膜の電気的パラメーターの測定 三角形の交互になる電圧信号を適用最大電圧 Umax = 50 mV と ΔTランプ= 50 ms は、長方形の交流電流応答を作成します。正と負の電流 (I+と私は-) の平均値から次の式によると膜の容量を計算します。 -50 に至る電圧ランプを適用 mV +50 mV と現在のレコードにします。-斜面はコンダクタンス – データを線形関数をフィットし、フィットの x 軸の交点を計算します。 プラスチックの先端ソリューションを放電増加基板濃度バッファーで新しいものを記入してください。 最初の 20-30 s 内膜が形成されない、ボリュームを排出し、それを補充します。膜間の濃度勾配は膜形成中に大きく変わらないことが保証されます。 膜の形成後 3.1 と 3.2 もう一度適切な膜の形成を確認して x 軸の交点を得るための手順に従います。 4. 基板回転率の計算 注: 詳細3、7の前の作業を参照してください。 脂質・ タンパク質 (M脂質および M蛋白質)、膜の 1 つの脂質ヘッド グループ (膜脂質) のエリアあたり蛋白質の質量比の分子の固まりから膜タンパク質の量を見積もる脂質 (r)。 ネルンストの運ばれた基板の可能性を計算します。R はガス定数、T 温度、z 輸送基質、F ファラデーの定数、および c の電荷1と c2の基板、膜の両側の濃度。 電流電圧の録音から取る逆潜在的な基板勾配の有無で線形フィットから x 軸の交差ポイントの差で計算されます。 ネルンストの潜在的な11の逆の可能性の比率によって基板コンダクタンス、G基板、総膜コンダクタンス、G合計の割合を計算します。 基板回転数 ΔN を計算基板基板コンダクタンス (G基板)、印加電圧 U、および基板 z: の電荷から時間単位 ΔT 単位 輸送基質タンパク質の数時間ごとの比率、売り上げ高率 κ を算出します。