Микро агар соль Мост электрод для анализа текучести Протон рекомбинантных мембранных белков
Summary
В электрофизиологические измерения наличие потенциальных диффузии мешает точное измерение обратной потенциал, изменяя электродный потенциал. С помощью микро агар соль мост, влияние диффузии потенциальных сводится к минимуму, что позволяет более точное измерение субстрата оборот чисел восстановленный рекомбинантных мембранных белков.
Abstract
На сегодняшний день, более 50% всех фармакологических препаратов целевой транспорта кинетика мембранных белков. Электрофизиологические характеристики мембранных белков перевозчик воссоздана в липидного бислоя мембраны это мощный, но тонкий метод для оценки их физико-химических и фармакологических свойств. Номер оборота субстрата является уникальный параметр, который позволяет сравнения деятельности различных мембранных белков. В electrogenic транспорта градиент translocated субстрата создает потенциал мембраны, которая напрямую коррелирует субстрата текучесть белка. С помощью электродов хлорид серебра, диффузии потенциал, также называется жидкий Джанкшен потенциал, наведено, который изменяет электродный потенциал и существенно мешает потенциальным измерения точные мембраны. Диффузия потенциальных могут быть уменьшиты соль мост, который уравновешивает электродный потенциал. В этой статье микро агар соль мост предназначен для улучшения электрофизиологических настройки, который использует micropipettes для формирования мембраны. Раствор соли заполняется в кончик микрокапиллярной пипетку, стабилизированная добавлением агарозы и может быть легко установлен Стандартный электрод. Электродный потенциал электрода микро солевой мост является более стабильным по сравнению с Стандартный электрод. Внедрение этой системы стабилизирует электродный потенциал и позволяет более точные измерения мембранного потенциала порожденных градиента рН. С помощью этой системы, Протон текучести митохондриальной перевозчиков, UCP1 и UCP3 связи и по сравнению с ранее измерений.
Introduction
Мембранные белки являются мишенью до 60% от всех известных фармацевтических препаратов1. Электрофизиологические измерения мембранных белков являются мощный, но тонкий инструмент для анализа electrogenic перевозки субстратов, посредничестве мембраны несущей белков. Модуляция трансмембранный ток приложением напряжения постоянного тока или напряжения рампы позволяет оценить фармакологических и физические свойства перевозчиков, например, активации и торможения субстратов или транспортом Кинетика. Особый интерес представляет номер оборота субстрат, который отображает количество субстрата, перемещен, мембранные белки в единицу времени. Это основной параметр, при сравнении кинетика различных мембранных белков. Создание градиента концентрации субстрата взимается через мембрану генерирует ЭДС, из которого выводится оборот количество субстрата.
С помощью AgCl электродов, наличие хлоридно свободный буфера создает потенциал диффузии, который изменяет электродный потенциал и приводит к смещению в измерения напряжения тока2. Хотя всегда присутствует, это незначительно для стандартных проводимости и измерения емкости, так как эти параметры являются либо зависимых на склоне вольт амперных запись (проводимость) или являются разница одной записи (мощности), который отменяет потенциал. Однако запись обратного потенциал, который создается на транспорте субстрата, может значительно встревожена диффузии потенциал. Таким образом для точного измерения обратного потенциал, электродных потенциалов должны быть неизменным.
Потенциального распространения могут быть уменьшиты двумя методами: (i) в присутствии из бислоя мембраны, концентрации субстрата должно быть увеличено на одной стороне мембраны3,4, или (ii) соль Мост остатки электродный потенциал 5. Первый способ заключается в значительной степени зависит от стабильности измерений. Мембрана имеет выжить в течение нескольких минут, от добавления субстрата при перемешивании до тех пор, пока субстрат почти равномерно распределены в решении. Если мембрана разрывов между ними, субстрат градиента изменяется путем свободного обмена заряженные молекулы, и измерения включите неточными. Последний метод остатки диффузии потенциальных, но ограничен размер структуры. Осуществление небольшой, но функционирования соль мост в микро диапазоне электрофизиологических настройки является сложным6. Для последнего метода раствор соли заполняется в кончик микрокапиллярной и стабилизированная добавлением агарозы для предотвращения диффузии соли раствора для буферного раствора.
В этом протоколе описан простой производства микро агар соль мост и внедрение в электрофизиологических настройки, основанные на пипетку set-up7 . Микрокапиллярной наконечник корректируется для содержать раствором KCl 3 M с 1 моль % (w/v) агарозы и преодоления AgCl электродов и буферной решение. Преимущество микро солевой мост отображается время записи электродный потенциал сдвига и более точные измерения мембранного потенциала в различных рН градиентов. В системе модель рекомбинантных белков в липосомах текучесть митохондриальной перевозчиков, UCP1 и UCP3, производится в аналогичных условиях связи и по сравнению с предыдущим результаты3,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Осуществление микро агар соль мост с электродом минимизирует его потенциал распространения и позволяет более точные измерения мембранного потенциала порожденных градиента рН. При наличии различных трансмембранного рН градиенты, потенциального сдвига обоих электродов является приемлемым на ΔpH = 0,35 при сравнении к значению теоретический потенциал уравновешения Нернста (ΦНернста = 23,8 mV для ΔpH = 0,4). Однако в более физиологических рН градиенты, как экземпляр в митохондриях между матрицей и межмембранное пространства, Стандартный AgCl электродов не позволяет точно измерить потенциал сдвига на ΔpH = 1 (рис. 3А). Электрод, мостовой с микро агар соли доставлены ценности, которые были гораздо более сопоставимы с теории.
Диффузия потенциал может возникнуть на электрод сравнения AgCl если буферный раствор изменяется во время эксперимента. Хлоридно свободный буферный раствор был использован в экспериментах с расцеплять белки были предложены для транспортировки хлорид-ионов, и pH была скорректирована с помощью трис или МЧС. Электродный потенциал, в отсутствие существенной концентрации хлорида, в первую очередь зависит от примесей хлорида в буферном растворе. Как его состав изменяется в ходе экспериментов, это просто приведет к постоянной смещения потенциал. Однако для измерения абсолютной разности потенциалов между двумя электродами, систему соли мост простой агар (Ag/AgCl 3 M KCl) может также использоваться для электрод сравнения.
Микро агар соль Мост остатки диффузии потенциал путем уравновешивания электродный потенциал. Для того чтобы стабилизировать раствор соли, агарозы 1% (w/v) был добавлен для предотвращения смешивания солевого раствора с буферным раствором. Соли ионов K+ и Cl– имеют аналогичные подвижности в жидкости и сбалансировать электродный потенциал. Чтобы правильно установить соль мост, солевой раствор Агар имеет достаточно нагревается заполнения кончик микрокапиллярной без каких-либо воздушных пузырьков и покрыть AgCl электродов. Перед дальнейшим использованием электрического контакта между электродом соль мост и электрод сравнения должна быть проверена. В зависимости от времени, которое используется соль Мост раствор соли должно быть достаточно загущенное для предотвращения любого смешивания солевого раствора с буфером. Это особенно важно, если расследование K+ или Cl– транспортеры. Соль мост был использован для очень короткое время и элюции агарозы незначительна в этот промежуток времени. Более высокую концентрацию агарозы до 5%, или агар (3% – 5%), позволяет использовать соль мост для более длительного периода времени6,12.
Этот метод позволяет определить транспорта кинетики мембраны транспортера (i) с низкой текучести и (ii) митохондриальных протеинов внутренней мембраны, которые вряд ли могут быть исследованы в структурах зажим Стандартный патч13. Его точность зависит главным образом от обратного измерение потенциала, точность которых уменьшается в проводимости низкой общей мембраны и небольших градиенты концентрации, которые вызывают мембранного потенциала ниже шум записи.
С помощью этой настройки, были измерены текучести UCP1 и UCP3, как производится на тех же условиях. Из-за более высоких рН градиента полученные показатели, как представляется, быть более точным и невозмущенной, артефакты, результате потенциального сдвига небольшие электродный. Он может использоваться для дальнейшего анализа и сравнения митохондриальной мембраны перевозчиков производится в аналогичных условиях.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана австрийский научный фонд (P31559-B20 в E.E.P.). Авторы благодарят Сара Bardakji за отличную техническую помощь в производстве и воссоздание мышь UCP1 и UCP3 в proteoliposomes.
Materials
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | Microcapillary pipette tip |
| Ethanol 99% | AustrAlco Österr. Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H | AAAH-5020-07025-230317 | |
| Kaliumchlorid | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 6781.3 | |
| DC supply | Voltcraft | V10/CPG 1940 -01 | |
| Agarose Standard | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3810.2 | |
| Patch Clamp Amplifier | Heka | ||
| Sample tube | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 5863.1 | |
| Na2SO4 | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 8560.3 | |
| MES | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 4256.2 | |
| TRIS | Carl Roth GmbH + Co. Kg | AE15.2 | |
| EGTA | Carl Roth GmbH + Co. Kg | 3054.1 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-100ML | |
| Hexadecane | Sigma-Aldrich | 296317-100ML | |
| Heating wire | Voltcraft | USPS-2250 |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents. Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).
- Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers. Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).
- Beck, V., et al. Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers. The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).
- Kleene, S. J. A simple intrapipette salt bridge. Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).
- Beck, V., et al. A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).
- Macher, G., et al. Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).
- Rupprecht, A., et al. Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak. Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).
- Hilse, K. E., et al. The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).
- Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).
- Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology. European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).
- Huang, D., Li, J. The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).
