Análise temporal de translocação Nuclear e citoplasmática de uma Herpes Simplex vírus 1 proteína pela microscopia Confocal imunofluorescência

Herpes simplex vírus 1 (HSV-1) faz com que uma ampla gama de leves a graves doenças herpéticas incluindo herpes labial, herpes genital, ceratite estromal e encefalite. Uma vez infectado, o vírus estabelece uma infecção latente ao longo da vida nos neurônios do gânglio. Ocasionalmente, o vírus pode ser reativado por várias razões, tais como febre, estresse e imunossupressão¹, levando a infecção de herpes recorrente. Célula infectada proteína 0 (ICP0) é um regulador de viral chave crucial para a infecção de HSV-1 lítica e latente. -Preferencialmente a jusante vírus genes através de contrariar o anfitrião intrínseco/inata defesas antivirais^2,3. ICP0 tem uma atividade de ligase E3 ubiquitina, que tem como alvo a diversos fatores de célula para degradação de proteossomo dependente³. Também interage com várias vias de célula para regular as suas actividades e, posteriormente, para compensar o anfitrião restrições antiviral³. ICP0 é conhecido para localizar em diferentes compartimentos subcellular enquanto a infecção prossegue^3,4,5. A proteína tem um sinal de localização nuclear de lisina e arginina-rich (NLS), situado em resíduos 500 para 506⁶. A síntese de novo no início infecção HSV-1, ICP0 imediatamente é importado para o núcleo. Primeiro é detectado em uma dinâmica nuclear estrutura denominado domínio nuclear 10 (ND10)⁷. A atividade E3 ubiquitina ligase ICP0 provoca a degradação de proteínas de organizador ND10, promielocítica leucemia (PML) proteína e proteína salpicados 100 kDa (Sp100)^8,9,10. Após a perda de proteínas do organizador, ND10 corpos nucleares estão dispersos e ICP0 é difundida para preencher o núcleo inteiro^4,11.

Curiosamente, após o início da replicação do DNA viral, ICP0 desaparece a partir do núcleo. Pode ser encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática no final de^4,de infecção HSV-1¹². A exigência da replicação de DNA implica o envolvimento potencial de um tarde antisentido viral em facilitar a translocação citoplasmática de HSV-1 ICP0^4,12. Aparentemente ICP0 tráfico entre diferentes compartimentos durante infecção capacita ICP0 modular suas interações para vários caminhos celulares de forma espaço-temporal, e, portanto, coordenar suas funções múltiplas à multa ajustar o equilíbrio entre o lítico e latente HSV-1 infecção¹³. Para entender melhor a multifuncionalidade do ICP0 e a coordenação de ICP0 domínios funcionais durante a infecção lítica, dissequei cuidadosamente a base molecular da dinâmica translocação ICP0¹². Para realizar os estudos mecanicistas anteriormente relatados¹², nós aplicamos um método de coloração imunofluorescente para visualizar a Localização subcellular ICP0 no status de infecção diferentes sob microscópio confocal. Também desenvolvemos um protocolo quantitativo para analisar a nuclear vs citoplasmática distribuição de ICP0 usando o software confocal. A população de células infectadas HSV-1 foi tabulada ao longo das fases de infecção e as tendências do movimento de ICP0 foram analisadas, sob diferentes tratamentos bioquímicos¹². Aqui descrevemos o protocolo detalhado a translocação de documentos ICP0 em infecção HSV-1. Propomos que este método pode ser adotado como um método geral para estudar a nuclear vs translocação citoplasmática para outras proteínas virais ou celulares, que pode servir como uma alternativa para imagens ao vivo quando a técnica de imagem ao vivo não é aplicável devido a problemas tais como rotulagem método, intensidade de sinal ou abundância de proteína.