Temporele analyse van de nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie van een Herpes Simplex Virus 1 eiwit door immunefluorescentie confocale microscopie

Herpes simplexvirus (HSV-1) 1 zorgt ervoor dat een breed scala van milde tot ernstige herpetic ziekten zoals herpes labialis, genitale herpes, stromale keratitis en encefalitis. Eenmaal besmet, wordt het virus een levenslang latente infectie in ganglia neuronen. Soms kan het virus worden gereactiveerd door diverse redenen zoals koorts, stress en immuun onderdrukking¹, leiden tot recidiverende herpes infectie. Geïnfecteerde cel eiwitten 0 (ICP0) is een belangrijke virale regelgever cruciaal voor zowel lytische en latente infectie van de HSV-1. Het transactivates stroomafwaarts virus genen via het tegengaan van de host intrinsieke/aangeboren antivirale verdedigingen^2,3. ICP0 heeft een E3 ubiquitin ligase activiteit, die gericht is op verschillende factoren van de cel voor proteasoom-afhankelijke degradatie³. Het interageert ook met verschillende trajecten van de cel om hun activiteiten te reguleren en vervolgens ter compensatie van de host antivirale beperkingen³. ICP0 is bekend om te zoeken op verschillende subcellular compartimenten naarmate de infectie^{3,4,5 vordert}. Het eiwit heeft een lysine/arginine-rijke nucleaire localisatie signaal (NLS) gelegen op residuen 500 naar 506⁶. Bij DOVO synthese op vroege infectie van de HSV-1, is ICP0 direct geïmporteerd in de kern. Het wordt eerst gedetecteerd bij een dynamiek van nucleaire structuur genoemd nucleaire domein 10 (ND10)⁷. De E3 ubiquitin ligase activiteit van ICP0 activeert de afbraak van ND10 organisator eiwitten, promyelocytic leukemie (PML) eiwitten en gespikkelde eiwit 100 kDa (Sp100)^8,9,10. Na het verlies van eiwitten van de organisator, ND10 nucleaire organen zijn verspreid en ICP0 wordt verspreid om te vullen de hele kern^4,11.

Interessant, na het begin van virale DNA replicatie verdwijnt ICP0 uit de kern. Het is uitsluitend gevonden in het cytoplasma, suggereert de aanwezigheid van een nucleaire-naar-cytoplasmatische translocatie laat in HSV-1 infectie^4,12. De eis van de DNA-replicatie impliceert de mogelijke betrokkenheid van een late virale expressie gebrachte eiwitten bij het vergemakkelijken van de cytoplasmatische translocatie van HSV-1 ICP0^4,12. Blijkbaar ICP0 handel tussen verschillende compartimenten tijdens infectie machtigt ICP0 te differentiëren van de interacties aan verschillende cellulaire routes in een ruimtelijke-temporele mode, en daarom coördinaat zijn meerdere functies te fine tunen het evenwicht tussen de lytische en latente HSV-1 infectie¹³. Om beter te begrijpen ICP0 multifunctionaliteit en de coördinatie van de functionele domeinen ICP0 gedurende de lytische infectie, ontleed we zorgvuldig de moleculaire basis van de dynamische ICP0 translocatie¹². Om uit te voeren het mechanistisch onderzoek eerder gemelde¹², hebben we een immunefluorescentie kleuringstechniek om te visualiseren subcellular localisatie van de ICP0 op verschillende infectie status onder confocal microscoop toegepast. We hebben ook een kwantitatieve protocol om te analyseren de nucleaire vs. cytoplasmatische verdeling van ICP0 met behulp van de confocal software ontwikkeld. De bevolking van HSV-1 besmette cellen was tabelvorm tijdens de fasen van de infectie en de trends van de ICP0 beweging werden geanalyseerd, onder verschillende biochemische behandelingen¹². Hier beschrijven we het gedetailleerde protocol dat documenten ICP0 translocatie in HSV-1 infectie. Wij stellen voor dat deze methode kan worden vastgesteld als een algemene methode om te studeren van de nucleaire vs. cytoplasmatische translocatie voor andere virale of cellulaire eiwitten, die als alternatief dienen kan voor levende imaging wanneer de levende imaging techniek niet van toepassing is vanwege is problemen zoals het labelen van de methode, signaal intensiteit of eiwit overvloed.