التحليل الزمني إزفاء النووية إلى هيولى بروتين الفيروس 1 الحلأ البسيط بالفحص المجهري [كنفوكل] إيمونوفلوريسسينت
Summary
ICP0 يخضع إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. ولا يعرف الآلية الجزيئية لهذا الحدث. هنا يصف لنا استخدام مجهر [كنفوكل] كأداة لقياس حركة ICP0 في هامبورغ-1 العدوى، الذي يرسي الأساس لتحليل كمي إزفاء ICP0 في الدراسات الميكانيكية في المستقبل.
Abstract
بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) لفيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) بروتين مبكر فوري الذي يحتوي على ليجاسى ubiquitin E3 عصابة من نوع. أنها مسؤولة عن تدهور proteasomal المضيف العوامل المقيدة وتفعيل الجينات الفيروسية اللاحقة. ICP0 يحتوي على تسلسل تعريب النووي المتعارف عليه (NLS). أنه يدخل النواة فورا بعد توليف حيثياته وينفذ مهامه الدفاع المضادة المضيف أساسا في النواة. ومع ذلك، لاحقاً في الإصابة، ICP0 يتم العثور على فقط في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى خلال هامبورغ-1 العدوى. يفترض أن يتيح إزفاء ICP0 ICP0 تعدل مهامها وفقا لمواقعها سوبسيلولار في مراحل مختلفة من العدوى. كي تحدد الوظيفة البيولوجية وآلية تنظيمية من ICP0 النووية إلى هيولى إزفاء، قمنا بتعديل أسلوب الفحص المجهري إيممونوفلوريسسينت لرصد الاتجار ICP0 خلال هامبورغ-1 العدوى. ويشمل هذا البروتوكول تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، [كنفوكل] مجهر التصوير، والنووية مقابل توزيع هيولى تحليل. والهدف من هذا البروتوكول التكيف مع حالة ثابتة [كنفوكل] الصور التي اتخذت في دورة وقت إلى توثيق كمية الحركة ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال. ونحن نقترح أن هذا الأسلوب يمكن أن يعمم لتحليل كمي النووية مقابل الحصول على التعريب هيولى من البروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى دون إشراك تكنولوجيا التصوير الحي.
Introduction
يسبب فيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) مجموعة واسعة من معتدلة إلى شديدة الأمراض الحلئيه بما في ذلك لابياليس الحلأ الحلأ التناسلي، التهاب القرنية stromal والتهاب الدماغ. وبمجرد إصابة، ينشئ الفيروس عدوى مدى الحياة كامنة في الخلايا العصبية ganglia. في بعض الأحيان، يمكن إعادة تنشيط الفيروس بأسباب مختلفة مثل الحمى والإجهاد وقمع المناعة1، مما أدى إلى إصابة القوباء المتكررة. بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0) منظم فيروسية أساسية حاسمة للحال والكامنة على السواء هامبورغ-1 العدوى. أنها ترانساكتيفاتيس الفيروس المصب الجينات عن طريق التصدي للمضيف الدفاعات المضادة للفيروسات مضمن الفطرية/2،3. وقد ICP0 بنشاط ليجاسى ubiquitin E3، الذي يستهدف عدة عوامل خلية لتدهور تعتمد على بروتوزوم3. أنه يتفاعل أيضا مع مختلف مسارات الخلية لتنظيم أنشطتها وبعد ذلك إزاحة القيود المضادة للفيروسات المضيف3. ومن المعروف ICP0 لتحديد موقع في المقصورات سوبسيلولار مختلفة كما تنتقل العدوى3،،من45. وقد البروتين إشارة تعريب نووية يسين/ارجينين–الغنية (NLS) الموجود في المخلفات إلى 500 5066. عند توليف حيثياته في وقت مبكر هامبورغ-1 العدوى، يتم استيراد ICP0 فورا إلى النواة. أنها أول مرة اكتشفت في دينامية نووية وصف بنية المجال النووي 10 (ND10)7. نشاط ليجاسى ubiquitin E3 ICP0 يتسبب تدهور البروتينات المنظم ND10، promyelocytic سرطان الدم (الرابطة الإسلامية) البروتين، والبروتين الأرقط 100 كاتشين (Sp100)8،،من910. بعد فقدان البروتينات المنظم، مشتتة الهيئات النووية ND10 وهو موزع ICP0 لملء4،أسرة نواة11.
من المثير للاهتمام، بعد بدء تكرار الحمض النووي الفيروسي، يختفي ICP0 من النواة. إلا يوجد في السيتوبلازم، مما يوحي بحدوث إزفاء النووية إلى هيولى متأخراً في هامبورغ-1 العدوى4،12. ويعني اشتراط تكرار الحمض النووي مشاركة محتملة أواخر protein(s) الفيروسية في تيسير نقل جسد هيولى من هامبورغ-1 ICP04،12. ICP0 الاتجار فيما بين الأقسام المختلفة أثناء الإصابة تمكن على ما يبدو ICP0 تعدل اتصالاتها على مختلف المسارات الخلوية بطريقة مكانية الزمانية، وتنسيق ذلك وظائفها المتعددة لغرامة ضبط التوازن بين الحال والكامن هامبورغ-1 العدوى13. لفهم أفضل لتعدد الوظائف ICP0 وتنسيق مجالات وظيفية ICP0 في جميع أنحاء العدوى الحال، نحن بعناية تشريح الأساس الجزيئي الحيوي إزفاء ICP012. لإجراء الدراسات الميكانيكية سبق الإبلاغ عنها12، المطبقة لدينا أسلوب المصبوغة إيمونوفلوريسسينت لتصور التعريب ICP0 سوبسيلولار في حالة الإصابة مختلفة تحت المجهر [كنفوكل]. كما قمنا بتطوير بروتوكول كمية لتحليل النووية مقابل هيولى توزيع ICP0 باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. كان جدولت سكان هامبورغ-1 إصابة الخلايا في مراحل الإصابة وحللت اتجاهات الحركة ICP0، تحت مختلف علاجات البيوكيماوية12. هنا نحن تصف البروتوكول مفصلاً أن إزفاء الوثائق ICP0 في هامبورغ-1 العدوى. ونحن نقترح أنه يمكن اعتماد هذا الأسلوب كوسيلة عامة للدراسة النووية مقابل هيولى نقل جسد للبروتينات الفيروسية أو الخلوية الأخرى، التي يمكن أن تخدم كبديل للتصوير الحي عندما يكون غير قابل للتطبيق نظراً لتقنية التصوير الحي مشاكل مثل تسمية الأسلوب، وكثافة إشارة، أو وفرة البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة إزفاء النووية إلى هيولى من هامبورغ-1 ICP0. ICP0 يخضع الاتجار سوبسيلولار خلال هامبورغ-1 العدوى (الشكل 1). من المحتمل يتفاعل ICP0 مع مختلف مسارات الخلية القيام بمهام مختلفة في مواقع مختلفة. وهذا يتيح ICP0 لتهذيب وظائفها المتعددة في شد مع الإنسان المضيف<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدعم المالي من منحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1AI118992) منحت قو هاي. ونحن نشكر مرفق الفحص المجهري، والتصوير وقياس الموارد (MICR) الأساسية في جامعة ولاية وين للدعم التقني.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. Herpes simplex viruses. Fields’ Virology. , 1823-1897 (2013).
- Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
- Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
- Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
- Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
- Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
- Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
- Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
- Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
- Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
- Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
- Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?. Future Virology. 13 (6), (2018).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
- Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
