Временной анализ ядерных и цитоплазматических транслокации герпеса вирус 1 белок, Immunofluorescent конфокальная микроскопия
Summary
ICP0 подвергается ядерной и цитоплазматических транслокации во время инфекции HSV-1. Молекулярный механизм этого события не известна. Здесь мы описываем использование Конфокальный микроскоп как инструмент для количественной оценки ICP0 движения в инфекции HSV-1, которая закладывает основу для количественного анализа ICP0 транслокации в механистической будущих исследований.
Abstract
Инфицированная клетка белок 0 (ICP0) вируса простого герпеса (ВПГ-1) 1 является немедленное раннего белок, содержащий убиквитин лигаза КОЛЬЦЕВОГО типа E3. Это ответственность за ухудшение протеосомной пребывания ограничительных факторов и последующих вирусных генов активации. ICP0 содержит последовательность каноническое ядерной локализации (NLS). Он проникает в ядро сразу же после de novo синтеза и выполняет свои функции Анти принимающей обороны главным образом в ядре. Однако позже в инфекции, ICP0 находится исключительно в цитоплазме, предлагая возникновение ядерного в цитоплазматического транслокации во время инфекции HSV-1. Предположительно ICP0 транслокации позволяет ICP0 модулировать свои функции согласно его субцеллюлярные места на этапах различные инфекции. Для того, чтобы разграничить биологической функции и механизм регулирования ядерной и цитоплазматических ICP0 транслокации, мы изменили методом immunofluorescent микроскопии для мониторинга ICP0 людьми во время инфекции HSV-1. Этот протокол включает в себя immunofluorescent окрашивание, Конфокальный микроскоп изображений и ядерной против цитоплазмы анализ распределения. Цель настоящего Протокола заключается в адаптации устойчивого состояния конфокальный снимки, сделанные в времени курс в количественных документации ICP0 движения на протяжении всего литические инфекции. Мы предлагаем, что этот метод может быть обобщена количественно анализировать ядерной против цитоплазмы локализации других вирусных или клеточных белков без привлечения живой технологии визуализации.
Introduction
Вирус простого герпеса (ВПГ-1) 1 вызывает широкий спектр легкой до тяжелой герпетические заболевания, включая labialis герпеса, генитальный герпес, стромальный кератит и энцефалит. После заражения, вирус устанавливает пожизненными латентной инфекции в ганглиях нейронов. Иногда вирус может быть возобновлена по различным причинам, такие как лихорадка, стресс и подавление иммунной1, приводит к инфекции рецидивирующий герпес. Инфицированной клетки белки 0 (ICP0) является ключевым регулятором вирусный решающее значение для литические и латентной инфекции HSV-1. Она transactivates вниз по течению вирус гены через противодействие хост внутренней/врожденной противовирусное оборону2,3. ICP0 имеет действие убиквитин лигаза E3, которая ориентирована на несколько клеток факторов для протеасом зависимой деградации3. Он также взаимодействует с различных путей клеток регулировать их деятельность и впоследствии компенсировать хост противовирусное ограничения3. Известно, что ICP0 найти на различных внутриклеточных отсеков, как инфекция переходит в3,4,5. Белок имеет лизин/аргинин богатые ядерной локализации сигнал (NLS), расположенный на остатки 500 до 5066. После de novo синтеза в ранней инфекции HSV-1 ICP0 немедленно импортируется в ядро. Обнаруживается сначала на динамический ядерные структуры называют ядерной области 10 (ND10)7. E3 убиквитин лигаза активность ICP0 вызывает деградацию ND10 Организатор белки, белка promyelocytic лейкемия (PML) и крапинами белка 100 кДа (Sp100)8,9,10. После потери Организатор белков ND10 ядерных органы рассредоточены и ICP0 распространяется для заполнения всего ядро4,11.
Интересно, что после начала вирусной репликации ДНК, ICP0 исчезает из ядра. Он находится исключительно в цитоплазме, предлагая возникновение ядерного в цитоплазматического транслокации инфекции HSV-14,12в конце. Требование о репликации ДНК подразумевает потенциального участия конце вирусные белки в содействии цитоплазматических транслокации HSV-1 ICP04,12. Видимо ICP0 торговли людьми среди различных отсеках во время инфекции дает ICP0 чтобы модулировать его взаимодействия различных клеточных путей в пространственно временных моды, и поэтому координировать его несколько функций для тонкой настройки баланса между литических и латентных HSV-1 инфекции13. Чтобы лучше понять ICP0 многофункциональности и координации ICP0 функциональные домены на протяжении литические инфекции, мы тщательно расчлененный молекулярные основы динамических транслокации ICP012. Для проведения механистический исследований сообщалось ранее12, мы применили метод immunofluorescent окрашивание визуализировать субцеллюлярные локализации ICP0 на различные инфекции статуса согласно конфокального микроскопа. Мы также разработали количественный протокол для анализа ядерных против цитоплазмы распределения ICP0 с помощью конфокальной программного обеспечения. Популяция клеток инфицированных HSV-1 был рассчитанной на этапах инфекции и были проанализированы тенденции движения ICP0, в12различных биохимических методов лечения. Здесь мы описываем подробный протокол, что документы ICP0 транслокации инфекции HSV-1. Мы предлагаем, что этот метод может быть принят в качестве общего метода для изучения транслокации цитоплазмы ядерной против других вирусных или клеточных белков, которые могут служить альтернативой живых изображений когда живой Тепловизионная техника не применяется из-за такие проблемы, как маркировка метод, интенсивности сигнала или белков изобилия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол был использован для изучения ядерной и цитоплазматических транслокации HSV-1 ICP0. ICP0 проходит, субцеллюлярные людьми во время инфекции HSV-1 (рис. 1). Вероятно ICP0 взаимодействует с различных клеток пути для выполнения различных функций в разных местах. Это позво?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим финансовой поддержке гранта NIH (RO1AI118992) присуждена Хайдун ГУ. Мы благодарим микроскопии, изображений и Core цитометрии ресурсов (MICR) объекта в Уэйнском Государственном университете для технической поддержки.
Materials
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., Arvin, A. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. Herpes simplex viruses. Fields’ Virology. , 1823-1897 (2013).
- Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
- Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
- Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
- Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
- Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
- Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
- Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
- Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
- Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
- Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
- Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?. Future Virology. 13 (6), (2018).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
- Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378 (2016).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
